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时间:2019-03-08
《幽门螺杆菌cag致病岛中hp0523基因功能鉴定和分析》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、江苏大学硕士学位论文摘要幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hpylori)的细胞毒性蛋白A(CagA)是一个重要的毒力因子,与胃癌的发生密切相关。其是通过Cag致病岛(cagpathogenicityisland,Cag—PAl)编码的Ⅳ型样分泌装置,转运进入胃上皮细胞,发挥毒性作用。而Cag.PAl中编码的基因功能及其致病机理均尚未十分明确。鉴此,本文初步研究了Cag-PAl中编码的hp0523基因的功能,并初步探讨其在CagA转运过程中的作用,旨在为深入研究Cag.PAl的致病机理奠定基础。方法:1.利用PCR技术从且py/or/基因组DNA中扩增获取hp0523基因,P
2、A克隆后构建pGEM.T-hp0523,进行序列测定;并对其序列进行生物信息学分析研究;2.构建pET-28a.hp0523原核表达载体,转化表达宿主菌BL21(DE3);经IFFG诱导后,SDS.PAGE法和Westernblot法鉴定表达后,并以Ni2+-NTA柱分离纯化目的蛋白;进一步对纯化蛋白进行生物学活性研究;3.扩增获得hp0523基因上下游同源臂片段F1、F2,构建自杀质粒pBlueKM40/Ahp0523::Km。,电击转化且pylori后经抗生素筛选hp0523基因缺失株,再进行PCR鉴定;4.采用hp0523基因缺失株和野生株与胃癌上皮细胞BGC.823进行共培养,而后采
3、用Westernblot法检测CagA蛋白转运能力变化。结果:1.扩增获得的hp0523基因全长为510bp,编码169aa,与GenBank公布的26695、J99同源性为92---95%:蛋白相对分子量Mr预测为19.7kDa,等电点∥为9.53;蛋白二级结构分析,在33"165位aa之间存在一个保守的SLT催化基序,第56位谷氨酸(GLU56)是催化活性的中心位点,C端序列上含有一个肽聚糖结合域“AVGAY”,故预测hp0523基因可能是一个肽聚糖水解酶编码基因;2.构建获得了原核表达载体pET-28a.hp0523,IPTG诱导后,经SDS.PAGE鉴定和Westernblot鉴定有
4、目的蛋白表达;采用Ni2+-NTA柱梯度洗脱后,分离获得了目的蛋白HP0523;江苏大学硕士学位论文3.HP0523经复性处理后,采用溶菌斑点实验证实其具有溶菌活力:而后采用SDS煮沸法分离提取获得细菌肽聚糖,进行凝胶酶谱分析后,发现HP0523蛋白具有肽聚糖水解能力;理化特性研究表明,HP0523具有广谱的溶菌能力,但酶活力较溶菌酶低;其最适酶活力pH值为6.0;4.连接F1、F2后构建自杀质粒pBlueKM40/Ahp0523::Km。,电击转化后经抗生素筛选,并经PCR验证后获得了hp0523基因缺失株;缺失株、野生株分别与胃癌上皮细胞BGC.823进行共培养后,发现hp0523基因缺
5、失株处理组,胃癌上皮细胞内未能检测到CagA的转运。结论:本研究认为hp0523基因是一个肽聚糖水解酶的编码基因,且其参与CagA的转运,可能是Cag.PAIIV型样分泌装置的组成成分之一。关键词:幽门螺杆菌,Cag致病岛,IV型样分泌装置,肽聚糖水解酶Ⅱ江苏大学硕士学位论文ABSTRACTCytotoxin—associatedgeneA(CagA)isthemostimportantvirulencefactorinHelicobacterpylori(HpylorO,whichinvolvedinthedevelopmentofgastriccarcinomainhuman.Itwas
6、translocatedintothehumangastriccellviaatypeIV-likesecretionapparatusthatencodedbytheCagpathogenidqisland(Cag—PAt)inH.py/or/.However,thefunctionofgenesandthemechanismofpathogenicityinCag·PAIarenotdear.Therefore,wefocusedontheidentificationandcharacterizationofthehp0523genefromCag—PAlinthisstudy.More
7、over,weexploredtheroleofhp0523intheprocessofCagA'stranslocation.AlloftheseresultswillshedlightonthemechanismofpathogenicityinCag—PAl.Methods:1.Thehp0523geneWasamplifiedfromtheH.pylorigenomicDNAviaaPCRmethod
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