幽门螺杆菌空泡毒素致病的分子机制分析

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1、业矬、r守泡毒素致纳的分j-．机制幽门螺杆菌空泡毒素致病的分子机制研究(摘要)博士研究生：袁建平导师：童普庆教授上海第二医科大学病原生物学教研室幽门螺杆菌(Hpylori)是一种革兰阴性微需氧菌，定居于胃粘膜，其持续感染与慢性萎缩性胃炎、消化性溃疡、胃癌以及胃淋巴瘤的发生密切相关。VacA是由H．pylori致病株产生的一种细胞毒素，由vacA基因编码产生的是140kDa前体毒素，经过加工形成94kDa成熟毒素。对于VacA作用机制的研究历经十余年，直至今天，VacA诱导细胞内空泡形成及其他效应的机制仍不十分明确。deBernard等人曾提出导致细胞空泡化的一个假设：Vac

2、A与细胞表面特异性受体结合并通过胞吞作用进入细胞，在细胞质中毒素或其片段作用于某一未知靶分子，使其在细胞内吞途径的晚期(晚期内体／前溶酶体腔室)调节膜的转运功能。但这仍是一个假设，VacA与靶分子的作用过程及信号转导途径对人们来说都还是未知的。要深入研究由VacA作用导致的宿主细胞的各种生物学改变，一个有效的手段是分析在病原或毒力因子作用下宿主细胞基因表达的变化。Suzuki等人的最新研究表明，胃上皮细胞Syntexin7表达的改变参与了VacA诱导的细胞空泡化过程，进一步证明宿主细胞基因表达的改变在各种毒力因子致病过程中发挥作用(SuzukiJeta1．JBiolChem

3、2003Apr30；[epubaheadofprint])。因此，本文的目的就是利用作为单一毒力成分的VacA蛋白作用于宿主细胞，研究细胞的应答，以揭示VacA导致宿主细胞病变的分子机制。为了达到这一目的，首先考虑的是在大肠杆菌中表达VacA蛋白。在过去的几年旱，许多研究小组试图通过这一方法得到具有完整活性的毒素蛋白，却均以失败告终。直到今年四月，McClain和Cover报道了他们成功地在大肠杆菌中表达有完整活性的VacA(McClainMS&CoverTL．InfectImmunApr2003；71：2266)。在本研究中，我们构建了表达VacA的原核载体，在大肠杆菌中

4、表达成熟毒素蛋白，SDS．PAGE电泳显示，在变性条件下，该蛋白裂解为37kDa和58kDa两个片段，提示两个片段之间的连结很脆弱，容易被打断。因此，我们又设计构建了VacA的真核表达载体，使蛋白直接在宿主细胞的胞浆内表达。结果表明，转染了该载体的HeLa细胞可以发生空泡化，而无须受体结合与膜转海带二医科大学博卜学位论文(2003)囊建、r空泡毒素数jiji的分予机制运的过程。但是，发生空泡化细胞的比例仅10％，而且在转染后30h才能见到空泡化现象，这可能是由于转染效率较低所致。这样，运用真核表达的方法研究VacA对宿主细胞的作用也遇到阻碍，这迫使我们必须设计一个更好的方案

5、来解决这一问题。我们的设想是构建一个vacA基因敲除的幽门螺杆菌突变株，它与野生株的唯一区别是vacA基因的缺失。这样，就为将来比较幽门螺杆菌VacA+野生株和VacA。突变株的毒力奠定了基础。在本研究中，我们首先在pBluscriptIISK中构建了用于同源重组的含卡那霉素耐受基因的克隆，通过电穿孔转化vacA+幽门螺杆菌NCTCll638。在含有卡那霉素的选择性培养基上挑取克隆，扩增并抽取DNA，通过PCR和DNA测序证实了等位基因的交换。突变菌的液体培养上清作用于胃上皮细胞后，不能导致细胞空泡化，从功能水平证实了vacA基因被敲除。这～人工构建的基因片段已被Geneb

6、ank接受，命名为“SyntheticconstructcysteinyltRNAsynthetase(cysS)，neomycinphosphotransferase(kmr)genes，completecds；andnonfunctionalvacuolatingcytotoxinprecursor(vacA)gene，partialsequence”，序列号为AY208922。在获得幽门螺杆菌vacA。突变株以后，用野生株和突变株分别作用于宿主细胞，利用表达谱芯片技术分析宿主细胞的差异表达基因。我们首先采用的细胞系是胃癌细胞系SGC7901，分别在感染后2，6，10，

7、24小时分析mRNA表达的变化。在不同时间段均有超过300个基因mRNA表达改变。根据它们在致病过程中表现出的不同功能，筛选出一些基因进行分类研究，并用Northernblot加以验证，细胞培养上清中蛋白表达的改变用ELISA证实。以往研究订实，VacA对细胞骨架的破坏是造成细胞空泡化以及细胞结构完整性和上皮屏障功能丧失的重要原因。因此，有必要研究VacA导致细胞骨架损伤的分子生物学机制。本研究发现，68个差异表达基因与细胞骨架有关，大多数表现为下调。肌动蛋白或与肌动蛋白相互作用的蛋白其mRNA表达下调。一个复杂的