噬菌体展示技术筛选幽门螺杆菌空泡毒素（vaca）

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1、噬菌体展示技术筛选幽门螺杆菌空泡毒素（VacA）【关键词】噬菌体展示；幽门螺杆菌；空泡毒素（VacA）；结合蛋白　　0引言　　我们应用噬菌体展示技术，以幽门螺杆菌(HelicobacterPylori,Hp)VacA基因片段作为固相筛选分子，筛选幽门螺杆菌VacA基因结合蛋白,探索VacA致病机制，研究VacA致病机制，为HP疫苗的研制和治疗等提供依据.　　1材料和方法　　1.1材料　　T7select人胃细胞cDNA文库，受体菌BLT5615（Novagen公司），质粒pGEMTeasy（Promega公司），Taq酶、琼脂糖,dNTP,T4连接酶、RNA酶，玻璃奶DNA回

2、收试剂盒（博大科技），BamHI,SacI等限制性内切酶（购于宝生物公司），热循环仪、凝胶成像仪、大肠杆菌DH5α为本实验室保存,引物合成与核苷酸序列分析由大连宝生物公司完成.　　1.2方法　　1.2.1Hpvaca基因扩增［1］采用PrimerDesigner引物设计软件设计，大连TaKaRa公司合成.在上下游引物的5′端分别引入BamHI,SacI限制性酶切位点，其中上游引物5′端用生物素标记.上游引物：5′TTGGATCCGAAATACAACAAACACACCT3′，下游引物：5′AAGAGCTCAGATTTTTGGAAACCACCTT3′.产物回收纯化.　　1

3、.2.2文库扩增摇菌BLT5615至A600nm值0.5，加入IPTG，30min后加入噬菌体文库4μL，37℃振摇直到细菌裂解，将裂解液4℃保存.　　1.2.3生物筛选链亲和素包被微孔板，4℃过夜；1×TBS洗涤，加入vacA基因回收片段，4℃过夜；1×TBST洗涤，加入文库扩增裂解液，4℃过夜；1×TBST洗板，加入200μLT7洗脱缓冲液，手摇室温孵育20min，取10μL洗脱噬菌体加入3mLBLT5615细菌培养液，37℃振摇培养，直到细菌裂解.收集裂解液4℃离心取上清4℃保存备下一轮筛选用.按上述步骤再筛选3遍.第二、三、四轮筛选分别以前一轮的裂解液代替文库扩增裂解液

4、，每轮筛选后，均做噬斑分析.　　1.2.4噬斑的PCR扩增取第4轮筛选后的阳性噬斑，进行噬菌体裂解，将噬斑裂解液PCR扩增，上游引物：5′GGAGCTGTCGTATTCCAGTC3′;下游引物:5′AACCCCTCAAGACCCGTTTA3.扩增条件：94℃变性60s,50℃退火55s,72℃延伸60s,循环35次后，72℃保温10min.10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增结果，玻璃奶法回收DNA片段.　　1.2.5序列比对和同源性分析　　选择不同长度且出现频率较高纯化的PCR产物与pGEMTeasy载体混合，在16℃条件下用T4DNA连接酶连接过夜，随后转化用氯化钙法

5、制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞，在铺有IPTG/Xgal的氨苄西林平板上进行蓝白斑菌落筛选，挑取白色菌落用T7引物鉴定，序列测定由大连宝生物公司完成.同源性搜索由以下上的BLASTn软件完成（http：//.ncbi.nlm.nih.gov/blastn）.　　2结果　　2.1HPvacA基因扩增（图1）.　　2.2胃细胞cDNA文库的筛选以固相化的HPvacA基因片段作为支持分子，对人胃细胞cDNA文库进行4轮“吸附洗脱扩增”的筛选.噬菌体的富集结果从固相平板洗脱的噬菌体数显示了明显的增加趋势（表1）.表1亲和筛选对噬菌体的富集（略）　　2.3目的基因的PCR扩增经过

6、4轮筛选，随机挑取46个噬斑为模板，用T7select引物进行PCR扩增，PCR产物用10g/L琼脂糖凝胶电泳.结果产生大小不等的条带（图2），用同一噬斑裂解液重复PCR得到同样结果.　　2.4序列比对和同源性分析　　对阳性克隆基因的DNA序列测定，并用BLASTn程序进行同源性搜索，共编码3种已知蛋白：核仁磷蛋白B23、抗氧化蛋白2、二硫化蛋白异构酶A2.　　3讨论　　噬菌体展示技术为研究DNA结合蛋白开辟了新的研究策略和技术途径［2-3］.Novagen公司构建的T7Select载体是将外源性DNA序列插入到T7噬菌体的包膜蛋白上，组建了3种不同表达强度的载体，外源cDNA

7、来自人胃细胞，插入片段长度在300~3000bp之间，该展示文库的特点是可以展示相当部分正常胃组织正在表达的蛋白质，甚至可以保持蛋白一定的空间构象，因此，该系统最大程度上再现了细胞内蛋白的真实情况，该系统筛选出的配体蛋白与自然状态较为接近.且该系统移框突变位点被去除，因此重组载体将仅表达一种蛋白并构成包膜蛋白.　　本试验用噬菌体人胃cDNA文库筛选得到幽门螺杆菌vacA基因DNA结合蛋白的基因片段，抗氧化蛋白2、二硫化蛋白异构酶A2为胃正常组织表达蛋白，有报道核仁磷蛋白B23在胃癌中表达下调