真菌毒素检测领域噬菌体展示技术的运用

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1、精选公文范文管理资料真菌毒素检测领域噬菌体展示技术的运用　　真菌毒素（mycotoxin）是由真菌产生的次级代谢产物，到目前为止已经发现超过1000多种真菌毒素，这些毒素仅由350多种真菌产生。真菌在陆地和海洋均广泛分布，在热带分布最广，因此污染也最重[1].目前，全球关于真菌毒素污染的报道日益增多，且受污染的也不局限于大米、玉米、小麦、大麦等主要粮食作物，还有药用植物、水果、坚果、牛奶等。毒性较强的真菌毒素有玉米赤霉烯酮（zearalenone,ZEN）、伏马毒素（fumonisins,FB）、黄曲霉毒素（aflat

2、oxins,AFT）、赭曲霉毒素A（ochratoxinA,OTA）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol,DON）、镰刀菌素（fusarin）、拟茎点霉毒素（phomopsins）、桔霉素（citrinin）[键入文字][键入文字][键入文字]精选公文范文管理资料等。不同的真菌毒素其致毒机制不同，表现为致癌毒性、细胞毒性、遗传毒性等多个方面。　　由于真菌毒素对人类健康有巨大危害，因此国内外科研人员研发了多种检测真菌毒素的技术，主要有仪器确证法和利用免疫学原理筛选检测的方法。仪器法主要是高效液相色谱法[2]

3、（HPLC）、质谱分析[3]（MS）、高效液相色谱-多级质谱法[4]等，这些方法显着的优势是能进行定性和定量分析且灵敏度高，但检测过程复杂、耗时、仪器设备十分昂贵、对实验室环境和实验员技能有严格的要求，从而限制了其用于大批量样品的筛选。利用免疫学原理进行大批量样品筛选检测的方法主要有酶联免疫吸附法[5]（ELISA）和免疫层析试纸法[6],因其特异性高、灵敏度强、操作简单，甚至可以实现现场检测而发展迅猛。但上述方法均使生产人员和操作人员须长期接触真菌毒素标品，对其健康造成潜在危害，并存在二次污染的隐患。因此，近年来新兴

4、的噬菌体随机肽库展示技术（phagedisplaytechnology）[键入文字][键入文字][键入文字]精选公文范文管理资料引起许多学者关注，并以此技术研究毒素的替代品及抗体参与免疫化学反应，建立了相关的无毒检测免疫学体系。　　1噬菌体展示技术简介　　　　SMITH[7]在1985年首次证实外源DNA可以插入丝状噬菌体基因Ⅲ中，并与pⅢ蛋白融合展示，从而创建了噬菌体展示技术。由于这一技术具有库容量大，结合特异性强等特点，促使科研工作者对噬菌体展示技术进行了深入的探索研究。　　这些研究促进了无毒检测食品及饲料中真菌毒

5、素体系的发展及昂贵真菌毒素抗体的替代。　　1.1噬菌体展示系统的原理　　　　噬菌体展示系统是一项选择技术，它将外源多肽或蛋白与噬菌体的一种衣壳蛋白融合表达，融合蛋白展示在病毒颗粒的表面，而编码这个融合子的DNA则位于该病毒粒子内。其原理是基于配体和受体反应的亲和选择性[8],即利用展示在噬菌体表面的多肽或重组抗体（配体）与目标抗体或抗原（受体）的亲和能力进行淘选（panning）[键入文字][键入文字][键入文字]精选公文范文管理资料,淘选到与受体具有高亲和性的、空间构象与目标配体结构类似的模拟表位，从而可用这模拟表位

6、取代相应的有毒抗原或不易获得的抗体。常用丝状噬菌体病毒包括f1、fd和M13三类，其基因组编码11种蛋白质，其中5种为结构蛋白，与噬菌体展示密切相关的是两种不同的结构蛋白pⅧ和pⅢ。pⅧ蛋白的N端（1-5氨基酸残基区域）为可活动的、外露在噬菌体表面的肽段，是插入外源基因的最佳位置；pⅢ蛋白最外露的是穿膜区（N端）,因而亦是插入外源基因的理想位置，形成的融合蛋白表达在噬菌体颗粒的表面，不影响和干扰噬菌体的生活周期，同时也保持了外源基因蛋白的天然构象，并可被相应的受体所识别。利用固定于固相支持物的靶分子，采用适当的淘洗方法

7、，洗去非特异结合的噬菌体，筛选出目的噬菌体，使得各种靶分子（抗体、酶、细胞表面受体等）的多肽通过体外选择程序得以快速鉴定。而其编码基因作为病毒基因组中的一部分可通过分泌型噬菌体的单链DNA[键入文字][键入文字][键入文字]精选公文范文管理资料测序推导出来。　　该技术实现了基因型和表型的转换。　　1.2噬菌体展示系统的分类　　　　噬菌体展示系统分为：丝状噬菌体展示系统、T7噬菌体展示系统、T4噬菌体与λ噬菌体展示系统；其所展示内容包括随机肽段、天然肽段、cDNA、抗体、抗体片段等。根据展示内容所建立的文库又可分为随机肽

8、库、抗体库、cDNA文库等，其中用于筛选真菌毒素的模拟表位和不易获得抗体的常用文库分别是随机肽库和抗体库。　　1.2.1噬菌体随机肽库随机肽库是将编码外源肽的DNA短序列插入到噬菌体编码外壳蛋白的基因组中，使各种组合的随机肽段与噬菌体外壳蛋白融合表达于噬菌体颗粒表面，被展示的肽可保持相对独立的空间构象和生物活性。而这特定的空间构象