噬菌体展示技术的应用 噬菌体展示

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1、噬菌体展示技术的应用噬菌体展示测定噬菌体滴度只有当噬菌体的感染复度MOI(噬菌体数/细菌数)值远低于1时（即细菌过量时），噬菌斑的数量才会随着加入噬菌体的量而呈线性增加。正因如此，建议检测噬菌体贮液的滴度时，在感染前进行稀释，而不是在高MOI值的情况下稀释被感染的细胞。低MOI值有助于确保每个噬菌斑仅含一个DNA序列。1.接种ER2738单菌落于5-10mlLB培养基中，摇床培养至对数中期（OD600~0.5）。2.细胞生长时，微波炉融化上层琼脂，分成3ml等份于灭菌试管中，每个噬菌体稀释度一管。保存于45℃备

2、用。3.37℃预温LB/IPTG/Xgal平板，每个噬菌体稀释度取一个平板备用。4.9在LB中准备10倍系列稀释的噬菌体。建议稀释范围：扩增的噬菌体培养物上清：108-1011；未扩增的淘选洗脱物：101-104。每个稀释度换一新鲜吸头，建议使用带滤芯吸头以避免交叉污染。5.当菌体培养物达对数中期，分成200μl等份于微量离心管中，每个噬菌体稀释度一管。6.每管加入10μl不同稀释度的噬菌体，快速震荡混匀，室温温育1-5min。7.将感染细胞加入45℃预温的上层琼脂培养管中，每次一管，快速混匀，立即倾注于37℃

3、预温的LB/IPTG/Xgal平板上。适当倾斜平板将上层琼脂均匀铺开。8.待平板冷却5min后，倒置于37℃培养过夜。9.检查平板，计数有~102个噬菌斑的平板上的斑数。然后用此数目乘以稀释因子即得到每109μl噬菌体的空斑形成单位（pfu）滴度。淘选程序最简单直接的淘选方法有：直接将靶分子包被于塑材表面（通过非特异的疏水作用或静电相互作用），洗去过量的未吸附分子，然后将噬菌体库覆盖在已包被的靶分子的表面。根据靶分子的不同，直接包被法偶尔会导致配体结合位点难以进入，这或许是由于分子的立体封阻或许是由于靶分子表面

4、的部分变性而引起。在这些情况下，可先将噬菌体库在液相中与靶分子进行预结合，然后将噬菌体-靶分子复合物亲和捕获于链霉亲和素包被的表面（见15页）或其他亲和介质上（见16页）。由于直接包被法相对简单，建议先按以下步骤试用此方法。如果没有淘选到明显的共有结合序列，再进行上述液相结合试验中的一种。第一天根据需同时在其上进行文库淘选的靶分子的数量和种类不同，淘选试验可以在单个灭菌聚苯乙烯培养皿、12-或24-孔板、96孔微量板中进行。每种靶分子至少包被一个板（或一个孔）。下述方法中给出的量是60×15mm培养皿的用量，括

5、号中为微孔板的用量，其他中等尺寸的孔相应地调整此用量。但每种情况下，加入的噬菌体数量都是相同的：2×1011个病毒子。1.准备100μg/ml的靶分子溶液（溶于0.1MpH8.6的NaHCO3）。如果需要稳定靶分子，也可使用其他相似离子强度的缓冲液（含金属离子等）。2.每板（孔）加入1.5ml（微孔板每孔150μl）上述溶液，反复旋转直到表面完全湿润（小心不要使溶液溅出）。3.在增湿容器（如：排列有湿纸巾的可封口塑料盒）中4℃轻微震荡，孵育过夜。平板可在此容器中4℃贮存备用。第二天4.挑ER2738单克隆（噬菌

6、体滴度测定时铺的板）于10ml9LB液体培养基中。如果同一天扩增洗脱的噬菌体，也可将ER2738接种于20mlLB液体培养基，这时请用250ml三角瓶（不要用50ml锥形管）。37℃剧烈震荡培养。5.倒掉每板中的包被液，板倒置在干净的纸巾上用力拍甩以除去残余溶液。每板（或孔）加满封阻液，4℃作用至少1hr。6.按5中所述方法除去封阻液。再用TBST(TBS+0.1%[v/v]Tween-20)缓冲液快速洗板6次。每次均旋转以使板或孔的底部及边缘均被洗到，倾去缓冲液，倒置在干净纸巾上拍甩以除去残余溶液（或使用自动

7、洗板机）。此操作要快以避免板干燥。7.用1ml（微孔板则用100μl）的TBST缓冲液稀释2×1011的噬菌体（即10μl的原始文库），然后加到已包被好的板上，室温温和摇动10-60min。8.倾倒除去未结合噬菌体，倒置板在干净的纸巾上拍甩除去残余溶液。9.按6中所述方法用TBST缓冲液洗板10次，每次换一干净纸巾以避免交叉污染。10.根据所研究的分子间相互作用，用1ml（微孔板则用100μl）适当的洗脱缓冲液洗脱结合的噬菌体。一般情况下，是将靶分子的已知配体以0.1-1mM的浓度溶于TBS溶液中或者用游离靶分

8、子溶液（~1009μg/ml溶于TBS中）从固定靶分子上将结合的噬菌体竞争性洗脱下来。室温温和摇动10-60min，将洗脱液吸入另一干净微量离心管中。10a.另外，也可用非特异性缓冲液如0.2MGlycine-HCl(pH2.2),1mg/mlBSA来分离已结合的分子：温和摇动>10min，洗脱液吸入另一干净微量离心管中。然后再用150μl（微量孔则用15μl）1MTris-HCl（p