噬菌体展示技术

《噬菌体展示技术》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、噬菌体展示技术1985年，SmithGP第一次将外源基因插入丝状噬菌体f1的基因Ⅲ，使目的基因编码的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面，从而创建了噬菌体展示技术。该技术的主要特点是将特定分子的基因型和表型统一在同一病毒颗粒内，即在噬菌体表面展示特定蛋白质，而在噬菌体核心DNA中则含有该蛋白的结构基因。另外，这项技术把基因表达产物与亲和筛选结合起来，可以利用适当的靶蛋白将目的蛋白或多肽挑选出来。近年来，随着噬菌体展示技术的日益完善，该技术在众多基础和应用研究领域产生的影响已日渐明显。1噬菌体展示技术的原理噬菌体展示技术是将多肽或蛋

2、白质的编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。肽库与固相上的靶蛋白分子经过一定时间孵育后，洗去未结合的游离噬菌体，然后以竞争受体或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体，洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增，进行下一轮洗脱，经过3轮～5轮的“吸附-洗脱-扩增”后，与靶分子特异结合的噬菌体得到高度富集。

3、所得的噬菌体制剂可用来做进一步富集有期望结合特性的目标噬菌体。2噬菌体展示系统2.1单链丝状噬菌体展示系统（1）PⅢ展示系统。丝状噬菌体是单链DNA病毒，PⅢ是病毒的次要外壳蛋白，位于病毒颗粒的尾端，是噬菌体感染大肠埃希菌所必须的。每个病毒颗粒都有3个～5个拷贝PⅢ蛋白，其在结构上可分为N1、N2和CT3个功能区域，这3个功能区域由两段富含甘氨酸的连接肽G1和G2连接。其中，N1和N2与噬菌体吸附大肠埃希菌菌毛及穿透细胞膜有关，而CT构成噬菌体外壳蛋白结构的一部分，并将整个PⅢ蛋白的C端结构域锚定于噬菌体的一端。PⅢ有2个位点可供

4、外源序列插入，当外源的多肽或蛋白质融合于PⅢ蛋白的信号肽(SgⅢ)和N1之间时，该系统保留了完整的PⅢ蛋白，噬菌体仍有感染性；但若外源多肽或蛋白直接与PⅢ蛋白的CT结构域相连，则噬菌体丧失感染性，这时重组噬菌体的感染性由辅助噬菌体表达的完整PⅢ蛋白来提供。PⅢ蛋白很容易被蛋白水解酶水解，所以有辅助噬菌体超感染时，可以使每个噬菌体平均展示不到一个融合蛋白，即所谓“单价”噬菌体。（2）PⅧ及其他展示系统。PⅧ是丝状噬菌体的主要外壳蛋白，位于噬菌体外侧，C端与DNA结合，N端伸出噬菌体外，每个病毒颗粒有2 700个左右PⅧ拷贝[8-9]

5、。PⅧ的N端附近可融合五肽，但不能融合更长的肽链，因为较大的多肽或蛋白会造成空间障碍，影响噬菌体装配，使其失去感染力。但有辅助噬菌体参与时，可提供野生型PⅧ蛋白，降低价数，此时可融合多肽甚至抗体片段。此外，尚有丝状噬菌体PⅥ展示系统的研究报道。PⅥ蛋白的C端暴露于噬菌体表面，可以作为外源蛋白的融合位点，可以用于研究外源蛋白C端结构区域功能。从所掌握的文献来看，该系统主要用于cDNA表面展示文库的构建，并取得了不错的筛选效果。2.2λ噬菌体展示系统（1）PV展示系统。λ噬菌体的PV蛋白构成了它的尾部管状部分，该管状结构由32个盘状结

6、构组成，每个盘又由6个PV亚基组成。PV有两个折叠区域，C端的折叠结构域（非功能区）可供外源序列插入或替换。目前，用PV系统已成功展示了有活性的大分子蛋白β-半乳糖苷酶（465ku）和植物外源凝血素BPA（120ku）等。λ噬菌体的装配在细胞内进行，故可以展示难以分泌的肽或蛋白质。该系统展示的外源蛋白质的拷贝数为平均1个分子/噬菌体，这表明外源蛋白质或多肽可能干扰了λ噬菌体的尾部装配。（2）D蛋白展示系统。D蛋白的分子质量为11ku，参与野生型λ噬菌体头部的装配。低温电镜分析表明，D蛋白以三聚体的形式突出在壳粒表面。当突变型噬菌体

7、基因组小于野生型基因组的82%时，可以在缺少D蛋白的情况下完成组装，故D蛋白可作为外源序列融合的载体，而且展示的外源多肽在空间上是可以接近的。病毒颗粒的组装可以在体内也可以在体外，体外组装即是将D融合蛋白结合到λD-噬菌体表面，而体内组装是将含D融合基因的质粒转化入λD-溶源的大肠埃希菌菌种中，从而补偿溶源菌所缺的D蛋白，通过热诱导而组装。该系统有一个很好的特点，噬菌体上融合蛋白和D蛋白的比例可以由宿主的抑制tRNA活性加以控制，这对于展示那些可以对噬菌体装配造成损害的蛋白质时特别有用。2.3T4噬菌体展示系统T4噬菌体展示系统是

8、20世纪90年代中期建立起来的一种新的展示系统。它的显著特点是能够将两种性质完全不同的外源多肽或蛋白质，分别与T4衣壳表面上的外壳蛋白SOC（9ku）和HOC（40ku）融合而直接展示于T4噬菌体的表面，因此它表达的蛋白不需要复杂的蛋白纯化，避免了