幽门螺杆菌cag致病岛内cag1基因功能的研究

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1、分类号8墨2墨：窆窆UDC579——密级坌珏编号lQ垫整!Q!塑12幽门螺杆菌cag致病岛内cagl基因功能的研究CHARACTERIZATIoNoFCAGJGENEINTHECAGPATHOGENICITYISLANDoF舰L肋鲋CTERPYLORI指导教师：邵世和作者姓名：凌峰申请学位：理学硕士专业名称：病原生物学论文提交日期：2013年5月论文答辩日期：2013年6月学位授予单位和日期：江苏大学2013年6月答辩委员会主席：黄新祥评阅人：独创性：声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已注明引用的内容以外，本论文不包

2、含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果，也不包含为获得江苏大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：硒2DB年占月6日l。学位论文版权使用授权书江苏大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、中国学术期刊(光盘版)电子杂志社有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致，允许论文被查阅和借阅，同时授权中国科学技术信息研究所将本论文编入《中国学位论文全文数据库》并向

3、社会提供查询，授权中国学术期刊(光盘版)电子杂志社将本论文编入《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》并向社会提供查询。论文的公布(包括刊登)授权江苏大学研究生院办理。本学位论文属于不保密学位论文作者签名：．Zol弓年二月占日指导教师签名：孑俨伫孕Zol；年‘月石日；年6月6日江苏大学硕士学位论文摘要幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hpylori)为人类胃部疾病的重要致病菌之一，世界范围内感染率达到50％。已证实，Hpylori感染与多种胃肠道疾病的发生密切相关，例如慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌和胃粘膜相关淋巴样组织(MALT)淋巴瘤。I型Hpylori菌株因携带

4、cag致病岛(cagpathogenicityisland，cagPAl)而致其毒性较强。致病岛编码的IV型分泌系统能够合成并转运Hpylori重要的毒力因子一细胞毒素相关基因A蛋白(Cytotoxin—associatedgeneA，CagA)进入到宿主细胞内导致细胞功能紊乱。本文选择了该组基因中的第一号基因cagl作为研究对象，通过微生物学、分子生物学、免疫学和生物信息学等技术探讨cagl基因的功能，为深入研究cag致病岛的功能和致病机制奠定基础。方法：1．根据已报道的Hpy／or／26695全基因序列，利用PrimerPremier6．0设计cagl全长基因引物，用PC

5、R方法从H．py／or／11637基因组DNA中扩增目的基因片段，T-A克隆后构建pMDl8．T-cagl载体，完成测序工作；使用生物信息学软件：DNAStar、ProtParam、ANTHEPROT5．0和SignalP4．1server对其基本的理化性质和信号肽进行预测分析，同时使用Tmpred、TMHMMv2．0和SOSUI对该蛋白的跨膜区域进行预测。2．使用PrimerPremier6．0设计去信号肽后的cagl基因引物，并构建原核表达载体pET-32a．cagl，将质粒转化入表达工程菌Rosetta(DE3)经IPTG诱导后，确定蛋白是否可溶，大量诱导蛋白后，使用Q

6、IAGEN系统Ni2*．NTA柱纯化目的蛋白。SDS．PAGE电泳、Westernblot分析和质谱方法鉴定目的蛋白。3．纯化后的Cagl融合蛋白免疫家兔，制得兔抗Cagl多克隆抗血清，酶联免疫吸附试验(enzyme．1inkedimmunosorbentassay,ELISA)测定抗体效价。4．利用同源重组原理，设计PCR引物并扩增cagl基因上下游同源臂片段，构建cagl基因缺陷自杀质粒pBlueKM40一Acagl：：kan，电转化进入Hpy／or／NCTCll637中，通过抗性筛选出阳性克隆，并使用PCR方法验证后，即获得cagl基因缺陷株。5．将Hpy／or／NCT

7、Cll637细菌菌体收集并裂解菌体，使用超高速低温离心机幽门螺杆菌cag致病岛内cagl基因功能的研究对Hpylori进行亚细胞分离，分为膜组分(包括内膜和外膜)、胞质组分和周质组分，包括周质间隙蛋白、胞质蛋白及膜蛋白，使用Westernblot方法，以兔抗Cagl多克隆抗体为一抗，检测Cagl蛋白亚细胞定位。6．将cagl基因缺陷株与NCTCll637野生株分别与胃上皮细胞GES．1共培养后，检测CagA蛋白转运量，研究cagl基因缺陷对CagA蛋白转运的影响。7．收集cagl基因缺陷株与NCTCll