幽门螺杆菌cag致病岛hp0540基因的克隆表达及其多克隆抗体的制备

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1、幽门螺杆菌Cag致病岛hp0540基因的克隆表达及其多克隆抗体的制备作者：韩军，邵世和，谢立苹，黄世腾，田树伟，黄河【摘要】目的：构建幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，Hp)Cag致病岛(Cagpathogenicityisland，CagPAI)编码的hp0540基因的原核表达系统，并制备其多克隆抗体。方法：应用PCR技术从Hp11637基因组DNA中扩增hp0540基因片段，克隆至pMD182T载体后，进行序列测定，并对其序列进行生物信息学分析;构建pET28ahp0540原核表达载体，转化表达宿主菌BL21DE3;经IPTG诱导表达后，SDS-PAGE

2、法鉴定目的蛋白的表达，并以Ni2+NTA柱分离纯化目的蛋白;将纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体并测定抗体效价。结果：成功克隆了hp0540基因，全长1086bp，编码361个氨基酸，与基因库公布的其他Hp菌株基因序列的核苷酸同源性为98%。工程菌诱导后SDSPAGE显示新生表达蛋白带，相对分子质量约为39000，经Ni2+NTA柱纯化后可获得重组蛋白，重组蛋白免疫新西兰大白兔后获得效价为1∶160000的多克隆抗体。结论：成功构建了hp0540基因的原核表达系统并制备了其多克隆抗体，为研究该基因的功能奠定了基础。【关键词】幽门螺杆菌;Cag致病岛;CagI;多克隆抗体13

3、　　[Abstract]Objective:Toconstructtheexpressionsystemofhp0540fromstrainNCTC11637ofHelicobacterpylori(Hp)andpreparethepolyclonalantibodyserumofCagI.Methods:Thehp0540genewasamplifiedbyPCRwiththegenomicDNAofHpNCTC11637astemplate.TheplasmidpMD182Thp0540wasconstructedviaTAclonemethodandsequenced.T

4、hesequenceofhp0540wasanalyzedthroughbioinformaticsapproach.TheexpressionvectorpET28ahp0540wasconstructedandtransformedintoE.coliBL21DE3bymolecularcloningmethod.TheproteinwasexpressedandcharacterizedviaSDSPAGEmethodafterinducedbyIPTG.ThetargetproteinCagIwaspurifiedandcollectedbyNi2+NTAagaros

5、e.Thepuriedproteinwasusedtoimmunizerabbittopreparepolyclonalantibodyserum.Results:Thehp0540hasbeenclonedsuccessfully.Thesequenceanalysisforhp0540showedthatitshared98%homologywithotherstrainsofHpinGenBank.Themolecularmassofthepurifiedproteinwas39000.Thepotencyofthepolyclonalantibodyserumwas1∶160

6、000.Conclusion:Weconstructedtheprokaryoticexpressionsystemandpreparedthepolyclonalantibodyserumsuccessfully,whichestablishedafoundationforthefunctioninvestigationofthehp0540.13　　[Keywords]Helicobacterpylori;Cagpathogenicityisland;CagI;polyclonalantibody　　幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，Hp)是一微需氧革兰阴性细菌

7、，世界上有50%人口因感染该菌而导致慢性胃炎、消化性胃溃疡、胃腺癌、淋巴样组织瘤等消化道疾病，世界卫生组织于1994年将其列为第一类致癌原[1-3]。高致病性菌株都含有一长度为40kb的Cag致病岛(Cagpathogenicityisland，CagPAI)，用以编码四型分泌系统(typeIVsecretionsystem，TFSS)，通过该系统细菌可以把一些诸如细胞毒素抗原(CagA)、空泡毒素A(VacA)、肽聚糖等致病因子注入宿主细胞，并进而引