胃蛋白酶提取猪皮胶原蛋白的工艺优化与过程模拟

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1、http://www.paper.edu.cn1胃蛋白酶提取猪皮胶原蛋白的工艺优化与过程模拟11,22，31,2111林海但卫华曾睿但年华陈驰曲健健叶易春1.皮革化学与工程教育部重点实验室，四川大学，成都，610065；2.四川大学生物医学工程技术研究中心，四川成都，610065；3.四川大学轻纺与食品学院，四川成都，610065；联系人：但卫华，教授，博导，Tel:028-85408988,E-mail:dwh-bio@263.net摘要:实时检测胃蛋白酶提取猪皮胶原过程中的羟脯氨酸含量，通过计算机软件的处理和模拟进一步

2、优化胃蛋白酶提取猪皮胶原的工艺条件，同时推测胃蛋白酶的一些重要特性。分别在水解0、2、6、10、14、18、22、26h时对四组不同胃蛋白酶用量（分别为1％，2％，2.5％，3％）的试样取样检测。采用一阶Hill方程可以较好的模拟胃蛋白酶提取猪皮胶原蛋白的进程，并且符合米氏方程的特征；用一阶指数衰减方程则可以表征胃蛋白酶水解速率的衰减过程。最后得出2％的胃蛋白酶用量和6h－7h的水解时间较为合理。关键词:胃蛋白酶，猪皮，提取，胶原蛋白，模拟1.引言胶原属于细胞外基质(ECM)，是一种具有生物功能的结构蛋白质，占人体蛋白质总

3、量的1/3，是构成皮肤、韧带、软骨、肌腱等结缔组织或器官的主要成分。胶原具有重要的生物学性质和较好的力学性能，具有良好的生物相容性和可生物降解性，还具有促[1-3]进细胞生长的特性。胶原有很多类型，现已鉴定识别的有26种之多。随着人们对胶原结构和性能的进一步认识和对胶原生物医疗作用的肯定，胶原在生[4][5,6]物医学领域的应用正逐步扩大，如作为可注射性胶原溶液、胶原基多孔支架材料以[7,8]及胶原止血海绵等的基本原材料。因此，生物医学领域对胶原特别是对I型胶原的需求量也在逐步的提高。然而，由于传统胶原提取工艺的原材料主要

4、是牛腱、鼠尾腱等，其来源十分有限且受到疯牛病的冲击而使其应用前景显得相对黯淡，因此从其它来源的动物物质提取医用胶原蛋白成为研究的热点。作为胶原提取的原材料，猪皮与其他材料（牛皮、鱼皮等）相比具有明显的优点：首先，其组成和结构与人体内的胶原组成和结构是最为接近的，这是减弱甚至完全避免目标产物免疫抗原作用非常重要的一点；其次，猪皮中I型胶原含量丰富，经过适当的前处理后可以有较高的产率；最后，猪皮原料丰富，价廉易得。目前，国内外以猪皮为原料酶法提取胶原蛋白的并不多见。酶法水解比酸法或碱法水解具有十分明显的优势，特别是，胃蛋白酶可

5、以在胶原链的非螺旋区特定位点打断胶[9]原肽腱，获得较低的免疫抗原性的胶原蛋白。李贺、刘白玲等人用胃蛋白酶提取猪皮1基金资助：教育部高等学校博士点专项科研基金资助，项目编号：20020610032；成都市科技计划项目-1-http://www.paper.edu.cn胶原，并对其结构进行了表征，认为用酶法提取的胶原蛋白最大程度的保持了其天然结[10]构，适合用作生物医用材料。周文常、但卫华、廖隆理等采用自制超临界CO2流体处理器纯化猪皮胶原后，再用国产胃蛋白酶提取胶原蛋白，得到高纯度的胶原蛋白且最大程度地保持了猪皮胶原的三

6、股螺旋结构。可见，采用胃蛋白酶法提取胶原的工艺方法较为普遍，也比较成熟。在参考借鉴前人研究并总结本研究室前期工作的基础上，在本研究中我们对酶法提取猪皮胶原蛋白工艺条件进行了优化设计，对水解过程进行跟踪检测并以数学方程的形式对其进行模拟，为进一步提高猪皮胶原蛋白产品的综合质量提供理论依据。2.材料和方法2.1材料纯化猪皮皮坯，自制。主要试剂与仪器：进口分装1:3000胃蛋白酶（Sigma）；对二甲氨基苯甲醛（上海三爱思）；其它化学试剂除特殊说明外均为市售分析纯，使用前未经任何提纯处理。84-1A型四联动磁力搅拌器，UV751

7、GD型紫外可见分光光度计，LabconcoFreeZone6型冷冻干燥机。2.2方法2.2.1主要思路和方案设计在前期工作的基础上，我们需要进一步确定的酶法提取猪皮胶原蛋白的工艺条件主要是胃蛋白酶的用量以及水解作用的时间。因此，以酶用量为主要参数安排试验，同时对水解过程保持跟踪检测，以羟脯氨酸的含量作为特征指标，用统计学的方法进行数据处理得出最佳时间，最后用数学方法对该过程进行模拟分析。2.2.2猪皮胶原蛋白的粗提取（1）预处理和浸酸：准确称取一定重量的干燥皮块（M0，约3g），用100倍质量的Tris-HCl(pH7.4

8、)缓冲液浸泡4－6h，低温保存(4℃)，间隔搅拌（开始时连续搅拌10min，之后每1h搅拌5min）。此时，皮块颜色均匀，稍有膨胀感，能明显观察到细小颗粒悬浮。到预定时间后，小心倒去清液。加入100倍质量的0.5MHAC，检测并保证pH值在2.20左右，于低温（4℃）静置浸泡2h。（2）酶消化：加入胃蛋