猪皮胶原蛋白的提取及其结构表征

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1、维普资讯http://www.cqvip.com第3O卷第3期湖北大学学报(自然科学版)VoL3ONo．32008年9月JournalofHubeiUniversity(NaturalScience)Sep．，2008文章编号：1000—2375(2008)03—0287—03猪皮胶原蛋白的提取及其结构表征周玉惠，叶正涛，肖立芳，刘海，孙艳斌，胡小方(湖北大学材料科学与工程学院，湖北武汉430062)摘要：采用较简便的酶法从猪皮中提取胶原蛋白，通过SDS-PAGE凝胶电泳、紫外光谱定性分析，证明所提取

2、胶原蛋白为I型胶原蛋白，计算得分子量约为320kD．利用FTIR、DSC进一步测试，实验结果表明胶原蛋白具有完整的三螺旋结构，即具有生物活性．关键词：I型胶原蛋白；猪皮；傅立叶红外；差示量热扫描仪；凝胶电泳中图分类号：0636．9；Q599文献标志码：A胶原蛋白是动物体内含量最多、分布最广的细胞外蛋白质，它广泛分布于结缔组织、皮肤、骨骼等部位，是皮肤、软骨、动脉血管壁及结缔组织的主要成分，起着支撑器官、保护肌体的功能．胶原蛋白是哺乳动物体内含量最多的蛋白质，占体内蛋白质总量的25％-30，相当于体重的

3、6[．一般蛋白质的提取方法分为酸法、碱法和酶法l2]．酸水解法迅速而彻底，但色氨酸全部被破坏，丝氨酸和酪氨酸部分被破坏，且产品得率低；碱水解法迅速且彻底，但含羟基和巯基的氨基酸，全部被破坏且产生消旋作用(结构变异)；酶提取法对胶原蛋白破坏性小，能更好更完全地得到活性蛋白，但水解不够彻底．猪肉产品在我国的肉类中占有主导地位，猪肉生产的过程中伴随产生大量的猪皮副产品，一般猪皮约占猪总体重的10％左右，这些副产品除一部分用于皮革、食品等行业外，绝大部分都未能很好地加以利用[4]．因此，如何合理利用猪皮，提高

4、猪皮的附加值，已成为当今国内各肉联企业和科研院所研究的主要问题，本文中利用较简便的酶提取法从猪皮中提取胶原蛋白，并对提取产物进行了一系列的分析测试．1实验部分1．1主要仪器和试剂冷冻离心机，冷冻干燥机(宁波新芝仪器有限公司)，电泳机电泳仪(北京六一电泳仪器厂)，匀浆机(Warning，USA)，差示扫描量热仪(TAQlOO)，傅立叶红~b(NicoletAvatar370)，新鲜猪皮(市售)，胃蛋白酶(1：3000，Sigma)，其他药品均为分析纯．1．2胶原蛋白的提取胶原蛋白容易受热变性，所以本实验

5、均在低于10℃的条件进行．1．2．1预处理将新鲜猪皮洗净去除皮下脂肪后脱毛切碎，浸人10的NaC1溶液中12h，以除去盐溶性杂质，用去离子水洗涤2—3次，然后加适量水打浆混匀．1．2．2酶提取预处理过的猪皮浆原料中分别加人0．5mol／L的HAc(1／20，v／v)和胃蛋白酶(1／20，w／w)，控制pH在2—3范围内，酶处理72h后，离心(3000r／min)分离取上层清液．1．2．3盐析在上层清液中加人NaC1进行胶原蛋白盐析，NaC1浓度为2mol／L，离心分离(8000r／min)，沉淀即为胶

6、原蛋白，然后将胶原蛋白重新溶解于0．5mol／L的HAc，重复盐析两次．1．2．4透析纯化干燥将胶原蛋白溶解于0．5mol／L的HAc中，然后在0．02mol／L的NazHPO4(pH8．8)中透析2—3d，每8h换一次透析液，所得的胶原沉淀冷冻干燥．收稿日期：2007—12—24作者简介：周玉惠(1981一)，女，硕士生维普资讯http://www.cqvip.com288湖北大学学报(自然科学版)第3O卷1．3胶原蛋白的分析测试1．3．1SDS-PAGE电泳SDS-PAGE电泳采用Sigma蛋白质

7、标记，浓缩胶和分离胶的浓度分别为5和7，上样量为10I，实验通过蛋白质标记制作标准曲线，计算所提取胶原蛋白分子量．1．3．2紫外光谱分析将胶原蛋白溶解在醋酸溶液中，因为胶原蛋白含有特殊官能团，它们在200—400nm之间有吸收，采用一17型紫外一可见分光光度计(美国PE公司)进行检测．1．3．3FTIR分析用NicoletAvatar360，胶原蛋白KBr压片进行测试．温度为25℃，扫描次数为32次，扫描范围为5O0—4000cm．1．3．4DSC分析采用TAQ100示差量热扫描仪，称取胶原蛋白样品4

8、mg，密封于铝坩锅，从0oC升温到120℃，升温速率为5℃／min，样品室N流量为50mI／min．2结果与讨论2．1胶原蛋白电泳结果分析图l是提取胶原蛋白与蛋白质标记的电泳图谱，从图谱可以清楚看到胶原蛋白三股螺旋的3种存在形式：单股a，a，二聚体，和三聚体)，结构，由此证明所提取胶原蛋白是工型胶原蛋白．图2是由蛋白质标记电泳结果绘制的分子量标准曲线．以相对迁移率(MR)对分子量的对数(1gM)作图，拟合曲线，得到线性方程为lgM=-0．932MR+5．