龟皮胶原蛋白的提取及结构表征（ⅰ）

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1、第32卷第4期湖北大学学报(自然科学版)Vol_32No．42010年12月JournalofHubeiUniversity(NaturalScience)Dec．，2010文章编号：1000—2375(2010)04—0434—04龟皮胶原蛋白的提取及结构表征(I)黄文，印大中。，朱泽瑞(1．湖南第一师范学院数理系，湖南长沙410002；2．湖南师范大学生命科学学院，湖南长沙410081)摘要：采用酶法从乌龟皮中提取胶原蛋白，用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方法检测龟皮胶原蛋白多肽产品分子量的分布，并将龟皮胶原蛋白和I型胶原蛋白样品进行

2、液相色谱分析(HPLC)，比较其氨基酸成分和含量．SDS-PAGE电泳结果分析表明龟皮胶原为I型胶原蛋白，分子量约为288ku．龟皮胶原蛋白中，甘氨酸的含量最高，占总量的24．69；其次是谷氨酸、精氨酸和丙氨酸，分别为9．95、8．08和9．31；天冬氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、酪氨酸等含量在5．58～1．28之间；组氨酸和蛋氨酸的含量最低，仅占0．79和0．09．由于龟皮胶原蛋白的含量高于I型胶原蛋白，且与I型胶原蛋白的氨基酸含量差异显著，因此，龟皮胶原蛋白可以作为一种重要的皮胶原进行开发和利用．关键词：龟

3、皮；胶原蛋白；SDS~PAGE；氨基酸中图分类号：Q95文献标志码：A胶原是生物体内的一种纤维蛋白，主要存在于皮肤、骨、软骨及肌腱等组织中，占人体或其他动物体总蛋白含量的25～33l1]．来源于动物皮的胶原一般统称为皮胶原，其主要组成为工型胶原和Ⅲ型胶原，它们都属于成纤维胶原．成纤维胶原因其化学组成、交联和螺旋结构的特点而具有较强的机械性能、低免疫原性、较好的生物相容性和可生物降解性等生物学特性，因而广泛应用于生物、医药、食品及材料等领域l_2]．人们对于猪皮或牛皮等哺乳动物胶原的研究比较充分，而水产、两栖、爬行等其他动物皮中的胶原蛋白的研究和开

4、发较少．随着养殖业的发展及中药材龟板的取用，将会产生大量的龟皮，但对龟皮的研究非常有限．本研究就乌龟胶原蛋白的提取、胶原蛋白分子量测定以及氨基酸成分分析做了一些分析，为开发和利用龟皮胶原蛋白提供科学依据．1材料与仪器1．1主要原料乌龟(湖南四进生物开发股份有限公司提供)，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂，透析袋(14000ku)，胃蛋白酶、I型标准胶原蛋白、高分子标准蛋白(均购自美国Sigma公司)，氯化钠，氢氧化钠，丙酮，冰醋酸，盐酸等试剂均为分析纯．1．2仪器和设备DYY一10型(ECP3000)三恒电泳仪，DYCZ-22A型垂直平板电泳槽，5

5、24型恒温磁力搅拌器，IC_6A型日本岛津高效液相色谱仪，凯氏定氮仪，D-37520Osterode超速冷冻离心机(德国)．2方法与步骤2．1胶原蛋白的提取2．1．1预处理将乌龟处死去头，锯开两边的骨桥，剔除龟肉，取龟的四肢及头部、尾部的皮肤，洗净．将洗净的龟皮切成5mmX5mm的小块，丙酮脱脂10h，风干，贮存于4℃下备用．2．1．2胶原蛋白的酶解本实验采用胃蛋白酶酶解法，胃蛋白酶可以在胶原链的非螺旋区的特定位点打断胶原肽健，最大程度地保持了其天然结构，适合用作生物医用材料．将预处理后的龟皮1g，用双收稿日期：2OlO一04—27作者简介：黄文

6、(1967一)，女，硕士，副教授，Email：hwx24703@yahoo．COITLcn436湖北大学学报(自然科学版)第32卷3．2龟皮胶原蛋白与I型胶原标准蛋白的氨基酸成分分析将龟皮胶原蛋白和工型胶原蛋白样品进行液相色谱分析，得结果如表2．从表2的相关系数比较可以看出龟皮胶原蛋白与I型胶表2龟皮胶原蛋白与I型胶原蛋白的原标准蛋白的氨基酸成分呈高度正相关，进一步说明龟皮胶氨基酸成分分析mg／100mg原蛋白为I型胶原蛋白．15种氨基酸含量比较发现：龟皮中有甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、赖氨酸(Lys)、苏氨酸(Thr)、酪氨酸(Tyr)

7、5种氨基酸含量高于I型胶原标准蛋白，其余lO种氨基酸含量低于工型胶原标准蛋白．龟皮与工型胶原标准蛋白的氨基酸含量的方差分析表明(见表3)：F>F1mm。，即P<0．01，胶原蛋白中15种氨基酸之间的含量差异达到极显著水平(F一33．74，)．由于龟皮胶原蛋白的含量高于I型胶原蛋白，且与工型胶原蛋白的氨基酸含量差异显著，因此，龟皮胶原蛋白可以作为一种重要的皮胶原进行开发和利用．进一步将龟皮胶原蛋白氨基酸含量进行多重比较(表4)表明：15种氨基酸中甘氨酸的含量最高，与其它14种氨基酸的含量差异极显著；其次是谷氨酸，它与精氨酸、丙氨酸差异不显著，与天冬

8、氨酸差异显著，与其它氨基酸差异极显著；再其次是精氨酸，它与丙氨酸、天冬氨酸和赖氨酸差异不显著，与丝氨酸、苏氨酸差异显著，与其它氨基酸差异