高效液相色谱法测定牛初乳中igg含量的方法研究

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1、维普资讯http://www.cqvip.com高效液相色谱法测定牛初乳中IgG含量的方法研究马燕芬陈志伟魏晓兵王心刚摘要采用高效液相色谱法对牛初乳中IgG含量进行测定，并与琼脂双扩散法进行比较，筛选出一种快速、精确测定IgG含量的方法。在牧场(非热应激条件，平均温度一lO)随机选取7头体况良好、体重、胎次、产奶量及分娩日期都相近的黑白花奶牛作为试验研究对象。分别在母牛分娩后不同时间内收集乳样，用液氮冷冻，然后于一7O的冰柜中保存，分析测定时再进行解冻，分别用琼脂双扩散法和高效液相色谱法测定牛初乳中IgG效价和含量

2、。结果表明：①选用反相键合色谱柱ZORBAX300SB-C18，流动相0．02mol／lPBS(pH值6．8)与乙腈的比例为95％：5％时，初乳各成分分离效果达到最佳；②选择流速为O．2ml／min时，初乳蛋白组分得到有效分离。与琼脂双扩散法相比，高效液相色谱法测定牛初乳中IgG含量具有分析速度快、灵敏度和精确度高、分离效果好、回收率高等优点。关键词高效液相色谱；牛初乳；免疫球蛋白G中图分类号Q512．2牛初乳通常是指奶牛分娩后7d。特别是3d内含众多蛋白的牛初乳中分离出来对其它蛋白质的分所分泌的乳汁目前牛初乳作为

3、一种功能性食品的离具有重要参考价值。本文采用高效液相色谱法对原料已经受到普遍关注，它的特殊性首先体现在其化牛初乳中IgG含量进行测定．并与琼脂双扩散法进行学组成及活性物质的含量上因此如何检测其活性比较，从而筛选出一种快速、精确的测定IgG含量的物质含量是目前亟待解决的课题。我们提出以牛初乳方法。中最重要免疫成分IgG为活性物质指标进行检测。牛l材料与方法初乳免疫球蛋白(Ig)总量约为5O～l00mg／ml，其中1．1试验乳样采集8O％以上是IgG免疫系统发育不健全的新生犊牛吸在牧场(平均温度一l0)随机选取7头体况

4、良收的IgG以未消化的状态直接通过肠壁进入血液而好、体重600～650kg、胎次为3-4胎、产奶量和分娩日获得被动免疫。这种被动免疫可保护犊牛免受外来疾期相近的黑白花奶牛作为试验研究对象。分别于母牛病的侵袭目前测定IgG含量的方法主要有：单向免分娩后72h内每隔8h收集一次奶样。以后每天收集疫扩散法、琼脂双扩散法、超滤法、酶联免疫吸附法、一次。共收集7d。奶样用液氮冷冻。然后于一7O冰放射免疫法、火箭免疫电泳法、颗粒荧光检测技术、化柜中保存．分析测定时解冻。学发光自显影法、紫外分光法等．其中液相色谱分离1．2仪器、

5、试剂及色谱分离条件法具有分析速度快、样品用量少、灵敏度高、分离和测1．2．1仪器定一次完成。易于实现自动化。可在工业流程中应用HP1100高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；等优点。并且液相色谱对其它生物成分的分析也存反相键合色谱柱ZORBAXPoroshell300SB—Cl8(75在广阔的应用空间。完善该种方法对生物成分分析mmx2．1mmi·d．，粒度5m，孔径300A)、ZORBAX和物质鉴定具有巨大的借鉴和应用意义特别是对300SB—Cl8(100mmx2．1mmi·d．，粒度5m，孔径免疫球蛋白这

6、种具有特殊抗体活性的蛋白．把它从富300A)(美国Agilent公司)；紫外检测器(VWD)(美国Agilent公司)；0．45Ixm微孔滤膜(型号GHPACRODISC，美国PALL公司)；超纯水机(型号AKFPcific，美国马燕芬，内蒙古农业大学动物科学与医学学院。010018，AKF公司)；BiofugeStratos低温高速离心机(德国内蒙古呼和浩特市昭乌达路306号。neraeus公司)；超声波振荡器(SK5200LH江苏扬中陈志伟、魏晓兵，山东理工大学分析测试中心。王心刚，山东理工大学生命科学学院。市

7、电子器材公司)；六孔梅花打孔器(孔径3．5mm，孔收稿日期：2006—11—13间距3mm)★山东省自然科学基金(奶牛热应激的补偿生长机制研1．2．2试剂究．2004Zx27)标准牛IgG，每毫升含牛IgG10mg，纯度>95％维普资讯http://www.cqvip.com马燕芬等：高效液相色谱法测定牛初乳中IgG含量的方迭堑(美国Sigma公司)；Na2HPO3(AR)；NaH2PO3(AR)；乙腈标准曲线。(色谱纯)(德国MerckKgaA公司)；NaN3(AR)；兔抗1_4准确度与精密度试验牛IgG血清(效

8、价比为l：32)(哈尔滨骆家军乳品研准确度试验：称取同一样品6份，3份测本底值，3究所)；盐酸(AR)；琼脂糖(电泳级)；氯化钠(AR)；l％份添加不同浓度IgG标准溶液，扣除本底均值，计算硫柳汞。平均回收率。1．2．3色谱分离条件精密度试验：称取同一样品3份，测均值，计算标流动相为0．02mol／1磷酸缓冲液fPBS)(pH值准差、变异系数(CV)。6,8