高效液相色谱法测定大鼠海马中5羟色胺含量的方法学研究

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1、高效液相色谱法测定大鼠海马中5-羟色胺含量的方法学研究作者：朱玲英，孔铭，彭蕴茹，王佩娟【摘要】目的建立了高效液相荧光色谱测定大鼠海马中5-羟色胺（5-HT）含量的检测方法。方法采用AlltimaC18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)，流动相为0.1mol/L磷酸二氢钾溶液甲醇(9∶1,V/V)，等度洗脱，流速1.0ml/min。激发波长（λEx）254nm，发射波长（λEm）338nm。结果线性范围为0.70～8.40ng(r=0.9999)；当信噪比为3（S/N=3）时，检出限为1.27×10

2、-3ng；日内测得精密度相对标准偏差(RSD)为0.7%；重复性测定相对标准偏差(RSD)为2.8%；加样回收率为88.6%～101.5%。结论该方法简便、准确、灵敏，特异性强，重复性好，适用于海马中5-HT的含量测定。【关键词】5-羟色胺；高效液相色谱；荧光检测；大鼠海马　　　　Abstract：ObjectiveThecontentof5-HTinhippocampusofratwasdeterminedbyhighperformanceliquidchromatograph-fluorescence(

3、HPLC-FLU).MethodsTheseparationanddeterminationwerecarriedoutbyfollowingconditions:AlltimaC18column(250mm×4.6mm,5μm),0.1mol·L-1KH2PO4-methanol(9:1,V/V)asmobilephase,flow-ratewas1.07ml·min-1.Thefluorescenceexcitationandemissionwavelengthsweresetatλ_(Ex)254an

4、dλ_(Em)338nm,respectively.ResultsThelinearrangeofthemethodwas0.70～8.40ng(r=0.9999)for5-HT.Thedetectionlimitof5-HTwas1.27×10-3ng,whentheratioofsignaltonoisewas3.Theinter-assayprecisionwas0.7%.Therecoverywaswithintherangeof88.6%～101.5%.ConclusionThemethodiss

5、imple,sensitive,reliableandhasstrongspecificityandgoodrepetition.Itissuitableforthecontentdeterminationof5-HTinhippocampusofrat,byhighperformanceliquidchromatography.　　Keywords：5-hydroxytryptamine(5-HT)；Highperformanceliquidchromatography；Fluorescencedetec

6、tion；Hippocampusofrat7　　5-羟色胺（5-HT）是人体内一种重要的生物活性物质，参与脑缺血、镇痛、学习、记忆等多种生理过程，该物质广泛存在于脊椎动物脑内，在外周神经和其它组织中含量很低，对机体正常生理功能起着重要的调节作用［1～3］。因此定量测定5-HT含量对神经精神疾病、遗传性疾病、脑血管病以及发病机制的研究具有重要的价值。文献报道测定5-HT含量方法有比色法、荧光法、免疫法、高效液相-电化学色谱法（HPLC-ECD）、高效液相-荧光色谱法（HPLC-FLD）［4］。本实验采用HPL

7、C-FLD对大鼠脑匀浆样品液直接进行5-HT含量的测定，通过对色谱条件的优化，建立了稳定、快速、灵敏的含量测定方法并用于大鼠海马中该类物质的测定，为疾病的发病机理研究提供依据。　　1仪器和试剂　　美国Waters高效液相色谱仪（510泵，474荧光检测器，717自动进样器及柱温控箱等）；Empower色谱数据工作站；瑞士Mettler万分之一、十万分之一及百万分之一电子天平；美国Milli-Q纯水器；三洋MDF-382E超低温冰箱，Beckman21R高速冷冻离心机，上海金达生化仪器厂XUF-1高速分散器。

8、　　5-羟色胺（5-HT）标准品（135735933907213美国Fluka公司）；甲醇为江苏汉邦科技有限公司的色谱纯甲醇；其它试剂均为分析纯。　　2方法　　2.1色谱条件色谱柱为AlltimaC18(4.6mm×250mm,5μm)，流动相为0.1mol/l磷酸二氢钾溶液-甲醇（9∶1V/V）；单泵等度洗脱；流速1.0ml/min，；λEx:254nm；λEm:338nm；柱温：35℃。7　　2.2标准品溶液