柱前衍生化高效液相色谱法分析茯苓多糖的单糖组成

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1、万方数据医药导报2009年9月第28卷第9期·1213·柱前衍生化高效液相色谱法分析茯苓多糖的单糖组成吴建元1，肖玉玲2，孙曼春1，王智勇1，方世平1(1．武汉大学中南医院医学科学研究中心，430071；2．武汉大学药学院，430071)[摘要]目的建立柱前衍生化高效液相色谱法分析茯苓多糖的单糖组成。方法用稀碱浸提法提取茯芩多糖，用三氟乙酸(1’FA)水解，通过1．苯基．3．甲基-5．吡唑啉酮(PMP)衍生水解后的单糖，衍生物采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)250nm紫外检测和梯度洗脱，研究茯

2、苓多糖的单糖组成。结果6种标准单糖的衍生物实现了良好的分离并具有良好的峰形。茯苓多糖是由葡萄糖组成的均一多糖，与文献报道的一致。结论该方法简便，结果准确，可用于茯芩多糖或者其他多糖的单糖组成分析。[关键词】茯芩多糖；衍生化；单糖；色谱法，高效液相，反相[中图分类号]R282．71；R284．1[文献标识码]A[文章编号]1004-0781(2009)09—1213-02茯苓是传统中药材，具有健脾宁心、利水渗湿等功效⋯，其药用部位为茯苓菌核。茯苓多糖是茯苓干燥菌核基本组成部分，约占干重的93．O％，易

3、溶于稀碱液而不溶于水。有文献报道其结构为带有伊(1—岖)支链的口·(1—日)一D．葡聚糖旧JJ。目前对茯苓多糖的研究主要集中在通过化学、物理学及生物学等手段对其进行结构修饰后用于抗肿瘤和免疫增强剂等方面HJj。多糖是广泛存在于自然界的天然高分子化合物，由单糖通过糖苷键连接而成。多糖的单糖组成测定是控制多糖质量标准和提供多糖基本信息的最重要环节。单糖组成分析是糖分析的一项基础而重要的内容。由于多数糖类物质不具备光学性质，因此对糖类物质采用色谱或电泳方法进行分离测定时，常用紫外或荧光试剂对糖类物质进行衍

4、生，以改善其光学活性，提高检测灵敏度’6J。HONDA等【71首次将具有强紫外吸收的1．苯基．3．甲基一5-吡唑啉酮(PMP)用于糖类物质的衍生，发现它能与还原性的糖在温和条件下反应，产物无立体异构体，且在245nm处有强吸收。笔者采用PMP柱前衍生化，用常规的紫外检测器和C，。烷基键合柱，建立了测定茯苓多糖单糖组成的灵敏、快速、准确、方便的高效液相色谱(HPLC)新方法。1材料与方法1．1仪器与试剂戴安公司Summit@HPLC系统(P680LPG型低压四元梯度泵；ASI-100自动进样器；TCC

5、-100柱温箱；PDA一100二极管阵列检测器；CHROMELEONTM色谱信息管理软件)；C18色谱柱(250rain×4．6mm，5p,m，DikmaTechnologies)。衍生化试剂PMP(1一苯基-3·甲基-5一吡唑啉酮化学纯，国药集团化学试剂有限公司)；三氟乙酸(TFA，化学纯，上海化学试剂公司)；单糖对照品：葡萄糖(>99．8％，Amrcsco)，甘露糖(99％，Sigma)，半乳糖(99％，Sigma)，鼠李糖(99％，Sigma)，葡萄糖醛酸(98％，上海化学试剂二厂)，阿拉伯糖

6、(>99．8％，Sigma)；乙睛和甲醇均为色谱纯，其他试剂均为分析纯。【收稿日期]2008-04-22【修回日期]2008．06—12[作者简介]吴建元(1979一)，男，湖北麻城人，在读博士，药师，主要从事中药有效成分研究。电话：(O)13277081776，E．mail：wujianyuan2006@yahoo．coin．ctlo1．2茯苓多糖的提取取过孑L径0．25m／n(60目)筛的茯苓粉末，溶于3℃的0．5mol·L‘1氢氧化钠溶液中【8J，搅拌至粉末溶解，此时溶液呈粘稠状态。5℃以下冷

7、藏，过夜，抽渣弃去，滤液以10％醋酸液中和至酸性，再加入等量95％乙醇，于3℃放置过夜，滤取沉淀，依次用纯化水、无水乙醇、丙酮洗涤后，减压抽干，置于燥箱中60℃以下干燥，即得茯苓多糖粗品，呈白色粉末。称取茯苓多糖粗品5．00g，溶于二甲亚砜(DMSO)中，在室温下搅拌数小时后，加入纯化水，继续搅拌，放置，抽滤。沉淀用无水乙醇、丙酮洗涤，置干燥箱中干燥，即可得茯苓多糖精制品一1。1．3茯苓多糖的水解取茯苓多糖样品40IIlg于安瓿中，再加入4mol·L4三氟乙酸溶液1mL，封管后于90℃水解8h，得水

8、解样品溶液，转移至EP管中离心，取上清液用0．3tool·L4氢氧化钠溶液调pH至中性。1．4衍生化标记分别称取半乳糖、葡萄糖和甘露糖各约0．018g，鼠李糖约0．016g，葡糖醛酸约0．019g，阿拉伯糖约0．015g溶于0．3tool·L。氢氧化钠溶液1．0mL中，配制每种单糖的标准溶液(约为0．1tool·L。)，分别取每种单糖的标准溶液100止混合，配制混和标准品溶液(每种单糖浓度约为1／60mol·L1)。取标准品溶液或茯苓多糖水解溶液50止于EP管中，依次