资源描述：
《改进的PMP柱前衍生化方法用于单糖的组成分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、Vol.27高等学校化学学报No.82006年8月CHEMICALJOURNALOFCHINESEUNIVERSITIES1456～1458[研究简报]改进的PMP柱前衍生化方法用于单糖的组成分析11121林雪,王仲孚,黄琳娟,白泉,贾敬芬(1.西北大学生命科学学院,陕西省生物技术重点实验室,西部资源生物与现代生物技术省部共建教育部重点实验室,2.分离科学研究所,西安710069)关键词HPLC;12苯基232甲基252吡唑啉酮(PMP);衍生化;糖中图分类号O658文献标识码A文章编号025120790(2006)0821456203单糖组成分析是糖结构分析的一项重
2、要内容.近年来发展迅速的柱前衍生化方法是使糖类物质带上紫外或荧光基团,用HPLC进行分离,用紫外或荧光检测,这种方法具有分离效率高、分析时间短、进样量少、检测限低及多模式等特点.PMP(12苯基232甲基252吡唑啉酮)是常用的衍生化试剂,衍生化反应通常是将糖类物质溶解在[1～3]NaOH溶液中,反应结束后用酸中和所产生的盐虽然不影响HPLC的检测及分析,但会降低质谱检测的灵敏度.本文用氨水替代NaOH溶液,反应后氨水可通过减压干燥除去,这样不仅简化了衍生化反应的后处理过程,而且不影响衍生物的质谱分析,省去了质谱分析前的脱盐处理过程.本研究建立了5种常见单糖的分析分离
3、模式,对其进行质谱分析,用所建立的方法对标准二糖及3种多糖样品中的单糖组成进行了分析,取得了满意的结果.1实验部分1.1仪器与试剂Waters269522996型高效液相色谱仪,色谱柱(SymmetryC18,5μmi.d.,319mm×150mm,美国Waters公司);基质辅助激光解析电离质谱仪(MALDI2TOF2MS,日本岛津公司).12苯基232甲基252吡唑啉酮(PMP)、鼠李糖(Rha)、木糖(Xyl)、甘露糖(Man)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、乳糖(Lac)及三氟乙酸(TFA)(分析纯,上海医药集团);乙腈(色谱纯,Fisher公司);氢氧
4、化钠、醋酸铵、冰醋酸及三氯甲烷(分析纯,天津化学试剂厂).[4,5]螺旋藻多糖样品SPPA21,SPPB21和SPPC21为本实验室提取、纯化.1.2实验过程(1)衍生化标记.以氨水作碱液对样品进行标记:分别称取甘露糖、葡萄糖及半乳糖各010180g,鼠李糖010164g,木糖010150g,溶于5mL氨水中,取该溶液100μL,与100μL的PMP/甲醇溶液(015mol/L)混合,在70℃下反应30min.取出后冷却至室温,加入115mL纯水,真空干燥,重复2次.干燥后的物质用1mL纯水及1mL氯仿溶解,充分振荡后除去有机相,重复3次.水相溶液以13000r/mi
5、n的速度高速离心2min后,用水稀释20倍,进行HPLC分析.(2)标准双糖与多糖的水解.分别称取乳糖及螺旋藻多糖SPPA21,SPPB21及SPPC21各2mg,加入2mol/L的TFA溶液1mL,封管,于121℃水解2h后,将样品真空干燥.(3)标准双糖与多糖水解物的衍生化及分析.将水解后的乳糖与多糖按上述衍生化方法进行衍生收稿日期:2005212202.基金项目:国家重点基础研究发展计划项目(批准号:2004CB520802)和陕西省重点实验室重点科研发展计划项目(批准号:05JS49)资助.联系人简介:王仲孚(1971年出生),男,博士,副教授,从事糖生物学与
6、糖工程学研究.E2mail:wangzhf@nwu.edu.cnNo.8林雪等:改进的PMP柱前衍生化方法用于单糖的组成分析1457化处理,按文献[3]的方法计算其摩尔比.2结果与讨论2.1糖的衍生化文献[2]用NaOH溶液对单糖进行PMP衍生化时(013mol/LNaOH,70℃),在衍生化反应结束后,用盐酸中和是一个重要的步骤.而本文用氨水代替NaOH,用PMP对糖类物质进行标记,反应后不需酸中和,而是加入纯水后,通过真空干燥除去过量的氨水,使待测样品达到中性,简化了反应步骤,5种常见单糖衍生物得到很好的分离.其结果见图1(A).Fig.1HPLC2UVchrom
7、atogramsofthePMPderivativesoffivestandardmonosaccharides(A)andlactosehydrolysate(B)(A)Peaks:1.Man;2.Rha;3.Glc;4.Gal;5.Xyl;(B)peaks:1.Glc;2.Gal.Mobilephase:acetatebuffer(011mol/L,pH=515)2acetonitrile(volumeratio78∶22);flowrate:1mL/min;UVdetection:245nm.2.2衍生物的质谱分析传统的PMP衍生化方法由于用盐
