狗脊多糖脱蛋白方法的研究.

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1、狗脊多糖脱蛋白方法的研究（万静梅艳)摘要：本文对狗脊多糖提取液中蛋白质去除方法进行了研究。通过Sevage法、三氯乙酸（TCA）法、胰蛋白酶法和胰蛋白酶-Sevage联用法去除狗脊多糖溶液中的游离蛋白质。结果表明三氯乙酸法脱蛋白效果最好，胰蛋白酶-Sevage联用法次之，Sevage法效果差，胰蛋白酶法脱蛋白效果最差。关键词：狗脊；多糖；蛋白质去除StudyonmethodofproteinremovalfromcrudeRhizomaCibotiipolysaccharidesAbstract：Inthispaper,theprotein

2、removingmethodsonpolysaccharideextractionfromRhizomaCibotiiwerestudied.Sevagemethod,TCAmethod,EnzymemethodandEnzyme-SevagemethodwereusedtoremoveproteinfromRhizomaCibotiiextractionrespectively.TheresultsshowedthattheeffectiveorderofthesemethodswasTCAmethod,thenEnzyme-Sevage

3、method,thirdlySevagemethod,andfinallyEnzymemethod.Keywords：RhizomaCibotii;polysaccharide;proteinremoving.1前言中药狗脊为蚌壳蕨科植物金毛狗脊Cibotiumbarometz(L.)J.Sm.的干燥根茎，是常用中药，历版的《中华人民共和国药典》均有收载。狗脊具有补肝肾、强腰膝、祛风湿、止痛、利尿之功效。临床应用治疗腰膝酸痛、手足麻木、半身不遂、白带遗精、血崩等症，以及用于治疗多种肿瘤[1]，而多糖是其重要的活性成分。目前，提取狗脊中药多糖

4、多采用水提醇沉淀法，这样得到的粗多糖中蛋白质含量较高，而据资料显示，粗多糖脱蛋白后其生物活性更高[1,2]。为了提高狗脊多糖的生物活性，便于下一步研究其生物活性与结构的关系，本文对狗脊多糖溶液脱蛋白的方法进行了初步的研究。因此，采用合理的脱蛋白工艺，对多糖结构研究将具有重要意义。本文采用Sevage法、三氯乙酸（TCA）法、胰蛋白酶法和Sevage-胰蛋白酶联用法分别对狗脊多糖脱蛋白进行了研究，以多糖的保留率和蛋白质的去除率为指标，采用正交试验法优选其脱蛋白工艺的最佳条件，为狗脊多糖脱除蛋白质提供科学依据。2材料与方法2.1.1实验材料及药

5、品狗脊多糖提取液（本实验室制备）。三氯乙酸、葡萄糖、苯酚、浓硫酸、正丁醇、氯仿等试剂均为分析纯。考马斯亮蓝G-250、胰蛋白酶(1:250)为生物试剂。2.1.2仪器UV757CRT型紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；HH-S型恒温水浴锅（金坛市亿通电子有限公司）；BS224S电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；GL-20G-II型离心机（上海安亭科学仪器厂）；HD-930型组合式全温摇床（太仓市博莱特实验仪器厂）；WH-3微型涡旋混匀器（上海沪西分

6、析仪器厂有限公司）。2.2实验方法2.2.1葡萄糖标准曲线的制备[3,4]取干燥的无水葡萄糖200.00mg置于500mL的烧杯中，加水溶解后转入1000mL容量瓶中，稀释至刻度制成贮备液。分别吸取贮备液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL，加水稀释至2mL，向各管中加入5％苯酚试剂1mL后充分混匀。沿试管壁加入浓硫酸5mL，振摇后置沸水浴中加热15min，立即转入冷水浴中冷却至室温。以蒸馏水为空白，在490nm波长处测定吸光度，以葡萄糖浓度和吸光度为坐标，得回归方程为：y=2.9509x+0.0293，相关系数：R2=0.9

7、99（x为葡萄糖的浓度，单位为mg/mL；y为吸光度）。图1葡萄糖标准曲线2.2.2蛋白质标准曲线的制备[3,4]称取牛血清蛋白10.00mg置100mL的容量瓶中，加水溶解后稀释至刻度制成贮备液。分别吸取贮备液0.125、0.25、0.375、0.5、0.625、0.75、0.875、1.0mL，加水定图2蛋白质标准曲线容至1mL，向各管中加入5mL考马斯亮蓝G-250溶液，混合均匀后，置于30℃水浴加热5min，取出后冷却至室温。以蒸馏水为空白，测量各管试剂在595nm波长处的吸光度，以蛋白质浓度和吸光度为坐标，得回归方程为：y=0.7

8、270x+0.4402，相关系数：R2=0.9987（x为蛋白质的浓度，单位为mg/mL；y为吸光度）。2.2.3狗脊多糖提取液中蛋白质含量的测定[3,4]取一定体积的狗脊多糖提