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1、乌骨藤多糖脱蛋白工艺的研究［摘要］目的优选乌骨藤多糖脱蛋白工艺。方法以蛋白脱除率和多糖保留率为评价指标，考察酶-Sevage法对乌骨藤多糖脱蛋白的效果。结果酶-Sevage法的蛋白脱除率分别为75.09%,多糖保留率分别为89.83%。结论酶-Sevage法脱蛋白的方法可行。［关键词］乌骨藤；多糖；脱蛋白［中图分类号］R284.2［文献标识码］A［文章编号］2095-0616(2013)23-55-03乌骨藤为萝？科牛奶菜属植物通关藤Marsdeniatenacissima(Roxb.)WightetArn.的干燥藤茎，主产于云南、贵州，始载于《滇南木草》［1］。乌骨藤味苦，性微寒，具有清热
2、解毒、止咳平喘、抗癌等功效，用于咽喉肿痛、肺热咳喘和疮痈癌肿，以乌骨藤制成的片剂和注射剂广泛用于治疗肝癌、胃癌、直肠癌等恶性肿瘤［2］,其抗肿瘤效果显著。前期实验证实,乌骨藤多糖具有抗肿瘤活性［3］,但有关其多糖的研究报道较少。为了对乌骨藤多糖的结构、空间螺旋构型及抗肿瘤活性进一步研究，本文对水提醇沉法制得多糖屮含冇的蛋白进行了分离，对其脱蛋白工艺进行了研究，选用酶-Sevage法脱蛋白，兼顾考虑蛋白脱除率和多糖保留率，优化乌骨藤粗多糖脱蛋白方法，有关乌骨藤多糖脱蛋白的研究尚未见文献报道。1材料乌骨藤购于安国杏林药材公司，经本校药学院中药鉴定教研室翟延君教授鉴定为萝？科植物通关藤Marsde
3、niaLenacissimaCRoxb.）WightetArn.的藤茎，保存于辽宁中医药大学标本馆中。紫外分光光度计（UV-1800型）；离心机（TDL-5-A）；电子天平（上海天平仪器厂）；pHih牛血清白蛋白（北京奥博星生物技术责任有限公司130225）；考马斯亮蓝G-250（国药集团化学试剂有限公司）；木瓜蛋白酶（国药集团化学试剂有限公司，6X106U/g）；葡萄糖；重精馆苯酚、浓硫酸、三氯甲烷、正丁醇均为分析纯。2方法2.1乌骨藤多糖的提取[4]取乌骨藤药材250g,加6倍量95%乙醇回流提取2次，每次lh,过滤，药渣挥干乙醇后加8倍量水100°C提取3次，每次2h,合并提取液，过滤
4、，滤液减压浓缩至适当体积，加入95%乙醇使乙醇体积分数达到80%,静置过夜，抽滤，沉淀用冇机溶剂洗涤，干燥得乌骨藤粗多糖。2.2乌骨藤多糖的含量测定[5]2.2.1葡萄糖标准溶液的制备精密称取105°C干燥至恒重的葡萄糖10.12mg,置于lOOmL容量瓶中，加蒸憾水至刻度，摇匀，得到葡萄糖标准溶液。2.2.2标准曲线的制备精密量取葡萄糖标准溶液0.4、0・6、0・8、1・0、1.2、1.4mL置于10mL具塞试管中,加蒸傭水补足至加L,分别加入5%苯酚液l.OmL,充分摇匀，再加入浓硫酸5.OmL,摇匀，置于40°C水浴中反应15min,冷却至室温，490nm处测吸光度（A）,另取蒸憾水2
5、mL按上述显色方法作为空白，以吸光度（A）为纵坐标，葡萄糖浓度（C）为横坐标,得回归方程:A二0.0608C-0.1281,r二0・9996。2.2.3样品中多糖的含量测定精密吸取样品溶液2.0mL,按“2.2.2”项下显色方法进行操作，分别测定吸光度，计算样晶屮多糖含量和多糖保留率，多糖保留率二脱蛋白后的多糖含量/脱蛋白前的多糖含量X100%o2.3乌骨藤多糖中蛋白质的含量测定[6]2.3.1蛋白质标准溶液的制备精密称取牛血清蛋白10.04mg,置于100讥容量瓶中，加蒸馆水至刻度，摇匀，得到蛋白质标准溶液。2.3.2标准曲线的制备精密吸取蛋白标准溶液0.2、0.4、0.6、0.8、l.O
6、mL置于10汕的具塞试管中，分别加入考马斯亮蓝染液5讥，加蒸饱水补足至6mL,摇匀，放置30min,另取蒸馆水lmL按上述方法做空白，595nm处测定吸光度(A),以吸光度(A)为纵坐标，牛血清蛋白浓度(C)为横坐标，得回归方程：A二0.0347C+0.02,"0.9992。2.3.3样甜屮蛋白质的含量测定精密吸取样品溶液l.OmL,按"2.3.2”项下显色方法进行操作，分别测定吸光度，计算样品中蛋白质的含量和蛋白质脱除率，蛋白脱除率二(脱蛋白前蛋白质含量-脱蛋白后蛋白质含量)/脱蛋白前蛋白质含量X100%o2.4酶-Sevage法脱蛋白方法考察[7]精确配制0.02g/mL的乌骨藤多糖溶液
7、100mL,加入木瓜蛋白酶2g,摇匀，调节多糖溶液的pH值使pH二7,恒温水浴40°C酶解lh,酶解结束后沸水浴lOmin灭活木瓜蛋白酶，离心除去变性蛋白沉淀，取上清液进行Sevage法脱蛋白，重复10次，测定蛋白脱除率和多糖保留率。3结果3.1结果分析采用酶法脱蛋白后联合Sevage法脱蛋白，分析所得蛋白脱除率和多糖保留率，以Sevage法脱蛋白次数为横坐标，分别以蛋白脱除率和多糖保留率为纵坐标绘图，结果见
