人乳头瘤病毒基因分型液态芯片的构建

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人乳头瘤病毒基因分型液态芯片的构建【摘要】目的:通过构建人乳头瘤病毒基因分型的液态芯片,建立高通量、灵敏和特异的HPV型别检测系统。方法:在LuminexTM平台上,采用国际公认的标准HPV质粒建立13种基因分型HPV芯片,选择引物及探针,将探针有效的偶联到微球上。结果:用LuminexTM平台建立了13型HPV芯片,对单一或两种标准质粒混合的样品均可准确分型。对分型检测的阳性标本进行基因测序,经美国NCBI数据库BLAST比对符合其检测型别。结论:利用LuminexTM平台构建了13种HPV型别液相芯片的诊断体系,具有高通量、快速准确等特点,适用于大规模临床样本的HPV基因分型的诊断。【关键词】人乳头瘤病毒（HPV）基因分型芯片　　人乳头瘤病毒（humanpapillomavirus,HPV）基因分型,对临床HPV感染疾病的诊断与治疗具有重要的意义。目前采用的PCR检测技术假阳性率较高、Southernblot或反向杂交方法进行操作繁琐,一次检测样本量有限,限制了其大规模筛查中的需要。我们拟利用LuminexTM平台系统［1-3］,构建人乳头瘤病毒基因分型的液态芯片,建立特异性强、高通量、高灵敏度的HPV型别检测系统。　　1材料和方法9 　　1.1材料　　HPV31、HPV35、HPV56全基因序列质粒,由美国ResearchandDevelopmentDigeneCorporationAttilaLrincz教授惠赠;HPV58全基因序列质粒由日本ToshihikoMatsukura教授惠赠;HPV45、HPV51、HPV53全基因序列质粒,由德国HeidelbergE.M.deVilliers教授惠赠;HPV6、HPV11、HPV16、HPV18含HPVL1区质粒的菌悬液,由第四军医大学皮肤科惠赠。fluorescencelabeledpolystyrenebeads（Luminexmicrosphere荧光聚苯乙烯球,直径为5600nm,带有功能性羧基,密度1.25×109/L）购自Luminex公司。　　TMAC(temtrameihylammdniumchloride)Lot043k82108、MES(2［NMorpholino］ethanesulfonicacid)(C6H13NO4SFW195.2)lot042k5467;NLauroylsarcosineSodiumSaltLot082k1028均购自Sigma公司,EDC:1ethyl3(3dimethylaminopropyl)carboclirmidehyddrocloride购自Pierce(Rockford,IL);streptavidinphycoerythrin(SAPE):购自MolecularProbesLot:83C21。　　1.2方法9 　　1.2.1引物及探针　　根据LuminexTM平台系统的要求,选择GP5+/GP6+系统,采用deRodaHusman［4］设计。所有选择的探针参考M.V.JACOBS［5］,通过使用美国NCBI数据库做BLAST比对研究。　　1.2.2HPV感染类型　　选择占外生殖器部位HPV感染类型的96%左右的HPV低危类型HPV6、HPV11和HPV53及高危类型HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58等为构建液态芯片的首批HPV型别。　　1.2.3探针偶联及偶联效率的检测　　通过寡核苷酸5′氨基与微球表面的羧基在偶联反应液中偶联,微球表面的羧基点通过MES和EDC而激活,为了减少蛋白在寡核苷酸与微球杂交中的相互干扰现象,探针设计时通过加上带生物素酶的碳臂,而有效的结合在微球表面。为了检测探针是否已连接到微球上,设计偶联探针的互补探针,在互补探针序列5′端加Biotin修饰。9 　　1.2.4微球杂交　　将带有C14臂探针的微球与待测的PCR产物按比例在终浓度为3mol/L的TMAC反应液中混合,通过核酸解连、杂交反应和SAPE染色后,通过Luminex100仪器（BIARAD技术平台）检测。　　1.2.5阳性质粒微球探针荧光值标准曲线的建立　　阳性质粒抽提后,以此为模板进行PCR扩增,将扩增后PCR产物进行浓度梯度稀释,各稀释产物分别与带有各型HPV探针的微球进行杂交、染色,最后进行LuminexTM100仪器BioPlex系统检测,根据BioPlex管理软件分析采用TheLogistic5PL计算标准曲线。　　1.2.6统计学处理　　使用SPSS10.0统计软件包进行统计学分析,对阳性质粒标准的检测数据,采用判别分析法,对结果进行方差分析,建立判别函数。　　2结果　　2.1阳性质粒抽提及PCR检测　　各型质粒经过重新抽提后,检测结果见图1。9 　　2.2阳性质粒PCR产物与微球探针的杂交反应结果　　2.2.1单一PCR的杂交反应　　用13种带有不同编号的微球分别与HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、和HPV58型探针偶联后,使13种微球分别带有不同的探针。将这13种微球同时放入一个反应体系中,在一个反应体系中加入一种HPV的PCR产物,进行杂交反应,经LuminexTM100BioPlex软件分析平台检测（表1）。表1应用液态悬浮芯片技术检测单纯一型HPV标准质粒结果（略）　　2.2.2混合不同PCR产物与探针的杂交反应　　将2种或3种质粒的PCR产物等量混合后变性,再分别与13型HPVDNA探针杂交,经SA－PE荧光染色后检测。结果显示2型PCR产物与相应2型探针杂交后,检测出所对应的荧光值均高于无PCR产物未发生杂交反应探针的荧光值,平均高出3倍以上。经检测全部13种质粒的检测结果均符合预期值,没有出现混乱杂交现象,同时各混杂的阳性PCR产物均可被检出(表2)。表2应用液态悬浮芯片技术检测两型混合HPV标准质粒结果（略）9 　　2.3对照检测　　采用HPV液相芯片系统对30例尖锐湿疣标本均检出分型,检出率为100%,而采用反向杂交技术建立的人乳头瘤病毒基因分型试剂盒检测,只有21例可检出基因分型,检出率为70%。为了验证液相芯片检测的结果,选择经液相芯片检测阳性的标本进行基因测序。115号为尖锐湿疣标本,经芯片检测为HPV11型和HPV6型混合感染。选择115#PCR产物送测序,经上海博亚生物技术有限公司测序GP5+端测序的结果:GACACTATGTGCATCCGTGACTACATCTGCCACATACACNAATTCCGATTATAAGGAGATACATGCGCCATGTGGAGGAATATGATTTACAGTTTATTTTTCA。GP6+端开始测序的结果:TCCTTATAATCTGAATTNGTGTATGTGGCAGATNTAGACACAGATGCACATAGTGTCATNTTNGTACTGCGTGTAGTATCTACCACAGTAACAAAA。经美国NCBI数据库BLAST比对,结果符合HPV11型和HPV6型。　　3讨论本研究是在LuminexTM100技术平台上开发对人乳头瘤病毒基因分型的检测和定量分析。应用国际上已公认的HPV质粒作为阳性参照标准,建立了13种HPV型别液相芯片的诊断体系;对HPV公用引物和13种HPV的探针进行了筛选,建立了PCR反应体系、9 杂交反应体系。研究结果显示,13种微球探针对相应的产物具有特异的杂交反应,彼此之间并不相互干扰,对于产物中有混合型同时存在时也可以有效的检出。通过建立了阳性标准质粒HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV35、HPV51、HPV56和HPV58的杂交后反应的浓度标准曲线,可有效的通过调用标准曲线,对样品的含量进行定量分析。通过对大量数据进行判别分析,确立了阳性诊断的标准和特征判别的函数,检测结果显示每通道通过的微球为80个以上时,检测的荧光值视为有效值,同时检测的荧光值去除背景值后,判别函数大于2时,视为阳性值。根据特别函数,对349例标准样本进行回代特别函数判别分析,判定在特别函数大于2时,其检测阳性标本的阳性准确率在96.7%以上。　　　　为了验证液相芯片检测的结果,实验中选择经液相芯片检测阳性的标本进行基因测序,经美国NCBI数据库BLAST比对,结果符合检测型别。本研究建立的HPV基因分型的液相诊断芯片与采用反向杂交技术HPV型别诊断试剂盒同时检测临床样品,结果发现对一些阳性PCR产物的样品,反向杂交方法未检测出,而液相诊断芯片可以检出,说明液相诊断芯片诊断方法的灵敏性优于反向杂交方法；本研究构建的液相诊断芯片操作步骤简单,诊断方法准确,一次可进行大量样本的检测,每一板可上样96份,因此可完成高通量的检测；同时液相HPV基因分型诊断芯片不仅可精确的检测出HPV的基因型别,还可对阳性标本进行定量分析,这对临床HPV感染疾病的诊断和治疗都有着重要的意义9 。【参考文献】　　［1］YeF,LiMS,TaylorDJ,etal.Fluorescentmicrospherebasedreadouttechnologyformultiplexedhumansinglenucleotidepolymorphismanalysisandbacterialidentification［J］.HumanMutationHumMutat,2001,17(4):305-316.　　［2］ChenJ,IannoneMA,LiMS,etal.AMicrospherebasedassayforsinglenucleotidepolymorphismanalysisusingsinglebasechainextension［J］.GenomeReash,2000,10(4):549-557.　　［3］KaderaliL,DeshpandeA,NolanJP,etal.Primerdesignformultiplexedgenotyping［J］.NucleicAcidsResearch,2003,31（61）:796-802.　　［4］JacobsMV,HusmanAM,VandenbruleAJC,etal.GroupSpecificDifferentiationbetweenhighandlowriskhumanpapillomavirusgenotypesbygeneralprimermediatedPCRandtwococktailsofoligonucleotideprobes［J］.JClin9 Microbiol,1995,33(4):901-905.　　［5］AdriaanJC,BruleVD,RenéP,etal.Snijders1GP5+/6+PCRfollowedbyreverselineblotanalysisenablesrapidandhighthroughputidentificationofhumanpapillomavirusgenotypes［J］.JClinMicrobiol,2002,40(3):779-787.9