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1、导流杂交基因芯片技术在人乳头瘤病毒基因分型的应用2结果2.1HybrMax法检测所有膜上阴性对照结果均为阴性,内对照点和Biotin对照点均为阳性。75例样本共28例阳性,其中单一感染21例,复合感染7例。HPV单一感染时,在膜芯片上相应HPV亚型探针位点处可见一蓝紫色斑点,双重或多重感染时,在膜上可见两个或两个以上显色斑点(图1)。2.2荧光定量PCR检测75例样本共检出25例阳性,其中单一HPV6/11亚型阳性15例,单一HPV16亚型阳性3例,单一HPV18亚型阳性2例,HPV6/11和HPV16均阳性1例,HPV6/11和HPV18均阳性4例。2.3HybrMax法与
2、荧光定量PCR比较75例标本HybrMax法28例阳性,荧光定量PCR25例阳性,经统计分析显示其差别无统计学意义(P＞0.05),表明二者在阳性结果中有较好的一致性,但实时荧光PCR有一定的漏检率,漏检标本包括2例53亚型及58亚型的单一感染和1例35和58亚型的复合感染。另外4例复合型感染除了有常见的6，11，16，18亚型外,还检出31，53,58,66及CP8304亚型(表1,2)。在以上检测到的亚型中33，58，66亚型都为HPV的高危亚型,说明HybrMax法在检测HPV复合感染以及高危型HPV检出方面具有优势。3讨论宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一,临床证明95.
3、0％～99.7％宫颈癌和高危型HPV感染有关[3]。而且不同亚型HPV对子宫颈癌致癌性有不同影响,因此,准确诊断HPV感染及其分型对宫颈癌筛查、早期确诊及治疗效果监测有着重大意义。HPV分型检测研究一直受到国内外学者的高度重视[4]。目前,对HPV感染的分型诊断主要方法有斑点杂交、Southern印迹及实时荧光PCR等。传统的斑点杂交、Southern印迹由于杂交过程操作复杂,耗时长(杂交需十几个小时甚至1d),检测低拷贝基因的敏感性不足,可能需要使用同位素等,表1基因芯片结果与荧光定量PCR结果的比较:由于匹基实时荧光PCR的试剂不能对HPV6和11两种亚型分别进行检测,因
4、此,当患者感染其中任何一种亚型时,其检测结果表示为HPV6/11亚型阳性.表2荧光定量PCR和基因芯片结果的χ2检验不适合临床常规检测。实时荧光PCR检测HPVDNA已经应用于临床,其灵敏度和可靠性已得到认可,但目前能检测的HPV亚型十分有限,主要包括常见的HPV6,11,16,18四种亚型[5],易漏诊其他HPV亚型的感染,不利于流行病学和病因学的进一步深入研究。基因芯片是近年来发展起来的可对病原体核酸进行高通量快速检测的技术[6]。HybrMax法是导流杂交技术结合低密度基因芯片技术,利用PCR扩增提高检测的灵敏度,分子杂交特异性高,是HPV基因型分型检测的新方法[7]。
5、运用其高通量检测的特点,达到对21种常见高危型和低危型HPV亚型在同一样品中进行分型检测。与现有的实时荧光PCR相比,具有很多优点:(1)利用芯片高通量的特点可一次性检测21种亚型,增加了HPV感染的检出率及不同亚型复合感染的检测率[3],尤其是高危型的检出；(2)芯片设计考虑了中国人感染HPV的特点,包含了中国人常见的3个亚型(53，66和CP8304亚型),有利于在我国筛查HPV感染；(3)有良好的质量控制体系。基因芯片上包括了阴性对照点、内对照点和biotin对照点,对基因扩增和杂交实行了全程控制；(4)整个检测过程仅需3.5h就可出具检验报告,检测时间短,能满足临床需
6、要；(5)结果可靠。本实验通过与实时荧光PCR的结果对比,说明HybrMax法的检测结果具有与荧光定量PCR相当的灵敏度和可靠性。本研究中,HybrMax法共检出10种HPV基因型,其中高危型的检出率为18.7％,混合型9.3％；而实时荧光PCR技术检出高危型13.3％,混合型6.7％。HybrMax法检出的高危型别包括HPV16，18，31，35，53，58，66型,其中HPV16，18型与泌尿生殖道肿瘤关系密切,尤其是宫颈癌。所以对尖锐湿疣患者进行HPVDNA的基因分型,对于判定预后,指导临床对高危型及多重型HPV感染患者长期随访,采取针对治疗措施,降低与HPV相关肿瘤的
7、发生率有重要意义。HybrMax法检测HPV亚型包含了PCR技术的高敏感性、导流杂交技术的快速性和基因芯片的高通量性,是一种适合目前临床筛查HPV感染同时对HPV进行基因分型的有效方法。虽然目前基因芯片技术成本昂贵,检测的可靠性、实用性还有待于进一步验证,但基因芯片技术用于HPV的分型检测有广阔的前景。【参考
