液相芯片技术在人乳头瘤病毒基因分型检测中的应用的研究

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1、中文摘要本的筛查、监视治疗干预和评价疫苗效果【5’6】。近年来，随着液相芯片技术的日渐成熟，其在病原微生物的基因诊断中也得到了广泛应用。研究内容：本研究利用LuminexTM技术平台，选取与临床感染密切相关的HPV23种高、低危型别(低危型包括HPV6，11，42，43，44等5种，高危型主要为HPVl6，18，3l，33，35，39，45，51，52，53，56，58，59，66，68，73，82，CP8304等18种)作为研究对象，选取23种型别的HPV样本，经测序及Blast验证为相应型别，将各型别L1区PCR产物进行重组克隆构建质粒库，作为阳性参照标准。设计基因分型检测系

2、统，并对HPV通用引物和探针进行了筛选，建立PCR反应体系、杂交反应体系，对影响杂交反应的因素进行系统的分析，获得最佳反应条件。质粒标准品的检测结果证明该方法可对HPV准确分型。为确立阳性诊断的标准，根据具有统计学意义的多次检测结果确定质控标准及参考值。以构建的HPV液相芯片基因分型系统对314例单一型和混合型临床HPV感染样本进行检测，同时以测序法作为检验标准，对Luminex法的准确度、特异性、灵敏度进行评价，为Luminex法运用于临床HPV基因分型检测做可行性研究。研究方法：1．构建23个型别的HPV-L1区质粒标准品库：通过查找genbank中待检测的23种型别的HPV

3、序列，选择Ll区的MY09／11引物扩增区作为目标序列。用HPV-PCR检测试剂盒对临床收集的样本进行HPV检测，对结果阳性者进行测序确认为23种待检测的型别。将每种型别的MY09／11引物扩增区的PCR产物进行纯化、重组克隆。对克隆质粒经测序再鉴定，检索GenBank，确认为相应型别。保存HPV6，11，42，43，44，16，18，3l，33，35，39，45，51，52，53，56，58，59，66，68，73，82，CP8304等23种型别的阳性克隆。作为HPV分型的阳性标准品库。2．HPV基因分型液相芯片检测系统的建立：PCR体系的建立：针对23种型别HPV的目标检测序

4、列，采用通用型引物Il硕士学位论文MY09／Il用于扩增HPVL1区的高保守区，同时设计一条引物P8用于扩增部分通用引物不能兼顾的型别。扩增产物为450bp。内参引物PCOI／02用于扩增人13-Globin基因，对样本提取及PCR过程进行质控，产物大小为221bp。目标扩增区域及内参片段的上游引物采用生物素标记，以便于液相芯片杂交检测。通过对阳性标准品及样本的扩增对PCR体系各组份以及PCR程序进行优化获得最佳扩增条件。杂交体系的建立：根据HPV-LI区基因序列特点，设计针对23种HPV型别的特异性探针；同时设计针对内参13-Globin片段的质控探针，对HPV分型检测系统的样

5、本提取及PCR过程进行质控。探针5’端以氨基修饰，25条探针按照LuminexTM平台技术方案分别偶联至特定编码的羧基微球上，制备成HPV分型检测的液相芯片。通过与阳性标准品的PCR产物进行杂交并以LuminexXM200进行检测，对杂交体系的各组份及杂交温度(45℃、50。C、55。C、58。C)进行优化。通过对多型标准品PCR产物的等比及不等比混合样品的检测，确定HPV基因分型液相芯片检测系统对临床混合型标本的检测性能；通过对同一标准品的5次检测，确定检测系统的重复性。3．参考值确定及质控体系建立．根据阳性标准品检测结果，确定判别检测结果的参考值，并以感染率最高的HPVl6型

6、作为检测系统的阳性质控品。检测体系中的阳性内参探针(PC)对样本提取及PCR体系进行质控，显色内参探针(CC)对微球偶联效率及杂交后显色过程进行质控。4．大样本检测对所建立液相芯片检测系统的性能评价：收集314例临床样本，为女性生殖道疾病患者及健康体检者的尿道分泌物、宫颈脱落细胞或疣体细胞保存液。用煮沸法提取样本DNA备用。以测序法作为验证标准，采用所建立的Luminex法对314例HPV样本进行基因分型检测，同时所有样本以测序法进行验证。以测序法作为检验标准，通过统计学方法计算，对Luminex法用于HPV分型检测的灵敏度，特异性，准确度等指标进行评价。III中文摘要结果：1．

7、对临床23种型别的HPV阳性样本进行PCR扩增，将扩增产物重组克隆，经测序验证，构建了HPV6，1l，42，43，44，16，18，3l，33，35，39，45，51，52，53，56，58，59，66，68，73，82，CP8304的阳性标准品(质粒)。2．本研究建立的液相芯片系统，通过对构建的阳性标准品进行检测，确定了PCR引物序列，以及PCR体系中各引物、DNA聚合酶、M92+、dNTPs等各组份的浓度和比例，并确定了PCR最适反应程序。在确定的体系中，HPV扩增区及内参片