人乳头瘤病毒基因检测及分型方法研究进展

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1、人乳头瘤病毒基因检测及分型方法研究进展【摘要】流行病学和分子生物学资料表明，人乳头瘤病毒(HPV)的感染能够引起子宫内上皮样瘤变(CIN)及宫颈癌的发生。并且HPV的不同型别致病力也存在差异,高危型别、高病毒载量的持续感染是促使宫颈癌发生的重要因素。因此，HPV感染的早期发现、准确分型及病毒定量对宫颈癌的防治具有重要意义。作者对HPV基因的检测和分型方法如核酸杂交、PCR、荧光定量PCR等，以及各方法的优缺点进行综述。【关键词】人乳头瘤病毒;聚合酶连反应;实时荧光定量;分子信标;文献综述　人乳头瘤病毒(humanpapillomavius，HPV)是促使子宫内上皮样瘤

2、变(cervicalintraepithelialneoplasia,CIN)及宫颈癌发生的已知的重要因素[1-2]。德国学者Haraldzur16Hausen因发现了HPV与宫颈癌之间的关系获得了2008年诺贝尔生理或医学奖。HPV具有多种型别，分为高危型和低危型，不同的型别致癌潜能存在差别。高危型、高病毒载量的持续感染可以引起宫颈癌的发生[3]。2009年5月召开的第25届国际乳头瘤病毒会议，说明了全球HPV的感染率呈上升趋势，并且出现了新的基因型别[4]。在我国，宫颈癌的发病率也呈上升趋势并且趋于年轻化，因此，HPV感染的检测、病毒定量、基因分型对临床宫颈癌的防

3、治具有重要意义。在相关资料的基础上，我们对HPV基因的检测和分型方法如核酸杂交、PCR、荧光定量PCR等，以及各方法的优缺点进行了系统的综述，以期进一步建立可靠、简便、快速的HPV检测、定量、分型方法。　　1HPV的结构　　HPV为双链环状DNA病毒，基因组约8000bp，分为早期编码区(earlyregion)、晚期编码区(lateregion)、非编码区(noncodingregion)，含8个可译框(openreadingframe，ORF)，其中早期ORF6个、晚期ORF2个。它属于无包膜病毒，由DNA核心和衣壳组成，结构示意图如图1。　　图1HPV基因组结

4、构示意图　　Fig1SchematicofHPVgenome　　2HPV的分型　　HPV根据生物学特征、致癌潜能可分为高危型(highrisk)和低危型(low16risk)。HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68属于高危型，HPV6、11、42、43、44属于低危型[5]。高危型整合于细胞基因组中，与宫颈癌的发生密切相关;低危型不整合于细胞基因组中，主要引起疣的发生。　　3HPV的检测及分型方法　　HPV不能体外培养，其检测主要是基于HPVDNA的分子生物学方法。　　3.1HPVDNA的核酸杂交检测　　核酸杂交检

5、测主要包括核酸印迹(Southernblot)、原位杂交(insituhybridization，ISH)、杂交捕获(HybridCapture,HCⅡ)。早期，HPV的检测主要是应用核酸印迹、ISH。核酸印迹是HPV基因分型的金标准，适用于其基因分型和HPVDNA分子质量分析，但灵敏度较低、操作复杂，需用新鲜的组织标本，用福尔马林等固定剂固定的组织中，DNA可发生交联或降解，从而影响杂交结果;ISH虽可进行定位，但特异性低。因此大大限制了它们在临床的应用。　　HCⅡ是Digene公司建立起来的一种非放射性的分子杂交化学发光信号放大系统。样品HPVDNA双链被

6、释放并分解为可杂交的核苷酸后，单链标记的固相化的RNA探针与目标HPVDNA杂交，DNARNA的杂交信号在固相载体上转化为免疫结合，由标记碱性磷酸酶的抗体介导产生化学发光信号。HCⅡ16是目前唯一被美国食品药品管理局(FDA)批准用于临床HPV筛查的方法[6]。HCⅡ能够区分HPV的高危型和低危型，但不能确定其具体型别。有时探针之间存在交叉反应[7]，并且敏感度低于PCR方法。尽管如此，它无需基因扩增，降低了实验污染的可能性;较之PCR方法，其假阳性、假阴性率均较低。作为一种筛查方法，HCⅡ法在临床仍得到了广泛应用[6]。　　3.2HPVDNA的PCR检测

7、　　PCR是20世纪80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点，能在一个试管内将所要研究的目的基因或DNA片段于数小时内扩增十万乃至百万倍,扩增出的足量DNA产物供分析研究和检测鉴定，从而提高了HPV感染的检出率。基于PCR衍生出了多种用于HPV检测和分型的方法。　　3.2.1型特异引物PCR　　型特异性PCR(typespecificPCR)是利用型特异引物，对组织标本提取的HPVDNA进行特异性的扩增，而后凝胶电泳进行检测和分析，从而判断感染与否及感染的型别。但是，单管只能检测1种