液相芯片技术在人乳头瘤病毒基因分型检测中的应用的研究(7238)

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1、㈨IIIIIIIrlIlrIrlPIIIY1997279硕士学位论文液相芯片技术在人乳头瘤病毒基因分型检测中的应用研究硕士研究生：彭春梅指导教师：陈晓光教授摘要目的和意义：宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，世界范围内每年大约有50万左右的新发病例，我国的患病率及病死率约占世界的1／3，其死亡率居女性肿瘤的第2位，已成为危害女性身体健康的主要杀手之一【l】。大量研究显示，人乳头瘤病毒(Humanpapillomavirus，HPV)感染是宫颈癌及宫颈上皮内瘤变(cervicalintraepithelialneopl

2、asia，C1N)的直接和主要病因。宫颈癌患者的HPV检出率可达99．17％，其归因危险百分比达90％以上【1，3】。HPV有100多种亚型，其中与泌尿生殖道感染相关的有40余种。根据其对生殖系统的致癌性可分为低危型和高危型，前者主要引起尖锐湿疣等良性病变，后者常引起宫颈癌等恶性病变【2，91。由于HPV的致病性及致癌性与其亚型密切相关，不同亚型以及高危型及低危型感染所导致的结果截然不同，而且同一高危亚型持续感染是导致癌变的主要因素，所以对其进行检测和分型对于临床诊断、癌变预防与治疗具有重要意义[41。液相芯片是基

3、于Luminex。M的一种多功能生物芯片的分析平台，有机整合了编码微球(color-codedmicrospHereorbead)、激光技术、应用流体学、最新的高速数字信号处理器和计算机运算法则，使其具有高通量，高灵敏度，高速度等特剧51。理论上Luminex法可以对一个样本中的100种不同的目的分子进行检测，而新开发的LuminexXMAP更能一次性检测到500种目的分子，在35～60min内可对96个不同样本进行检测，且灵敏度高，信噪比好，只需要微量的样本即可进行检测，价格低廉，可以广泛用于大规模流行病学的调查

4、、临床样中文摘要本的筛查、监视治疗干预和评价疫苗效果【5’6】。近年来，随着液相芯片技术的日渐成熟，其在病原微生物的基因诊断中也得到了广泛应用。研究内容：本研究利用LuminexTM技术平台，选取与临床感染密切相关的HPV23种高、低危型别(低危型包括HPV6，11，42，43，44等5种，高危型主要为HPVl6，18，3l，33，35，39，45，51，52，53，56，58，59，66，68，73，82，CP8304等18种)作为研究对象，选取23种型别的HPV样本，经测序及Blast验证为相应型别，将各型别L

5、1区PCR产物进行重组克隆构建质粒库，作为阳性参照标准。设计基因分型检测系统，并对HPV通用引物和探针进行了筛选，建立PCR反应体系、杂交反应体系，对影响杂交反应的因素进行系统的分析，获得最佳反应条件。质粒标准品的检测结果证明该方法可对HPV准确分型。为确立阳性诊断的标准，根据具有统计学意义的多次检测结果确定质控标准及参考值。以构建的HPV液相芯片基因分型系统对314例单一型和混合型临床HPV感染样本进行检测，同时以测序法作为检验标准，对Luminex法的准确度、特异性、灵敏度进行评价，为Luminex法运用于临床

6、HPV基因分型检测做可行性研究。研究方法：1．构建23个型别的HPV-L1区质粒标准品库：通过查找genbank中待检测的23种型别的HPV序列，选择Ll区的MY09／11引物扩增区作为目标序列。用HPV-PCR检测试剂盒对临床收集的样本进行HPV检测，对结果阳性者进行测序确认为23种待检测的型别。将每种型别的MY09／11引物扩增区的PCR产物进行纯化、重组克隆。对克隆质粒经测序再鉴定，检索GenBank，确认为相应型别。保存HPV6，11，42，43，44，16，18，3l，33，35，39，45，51，52，

7、53，56，58，59，66，68，73，82，CP8304等23种型别的阳性克隆。作为HPV分型的阳性标准品库。2．HPV基因分型液相芯片检测系统的建立：PCR体系的建立：针对23种型别HPV的目标检测序列，采用通用型引物Il硕士学位论文MY09／Il用于扩增HPVL1区的高保守区，同时设计一条引物P8用于扩增部分通用引物不能兼顾的型别。扩增产物为450bp。内参引物PCOI／02用于扩增人13-Globin基因，对样本提取及PCR过程进行质控，产物大小为221bp。目标扩增区域及内参片段的上游引物采用生物素标记

8、，以便于液相芯片杂交检测。通过对阳性标准品及样本的扩增对PCR体系各组份以及PCR程序进行优化获得最佳扩增条件。杂交体系的建立：根据HPV-LI区基因序列特点，设计针对23种HPV型别的特异性探针；同时设计针对内参13-Globin片段的质控探针，对HPV分型检测系统的样本提取及PCR过程进行质控。探针5’端以氨基修饰，25条探针按照LuminexTM平台技