导流杂交基因芯片技术在人乳头瘤病毒基因分型的应用论文

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1、导流杂交基因芯片技术在人乳头瘤病毒基因分型的应用论文【摘要】目的探讨对人乳头瘤病毒(HPV)感染进行准确快速基因诊断和分型的方法。方法采用导流杂交基因芯片技术和实时荧光PCR对75例疑似HPV感染的标本进行基因诊断和分型。结果基因芯片阳性28例,其中单一感染21例,多重感染7例；实时荧光PCR阳性25例。二者在阳性结果中有很好的一致性。结论导流杂交基因芯片技术适合临床筛查HPV感染及对HPV进行基因分型。【关键词】乳头瘤病毒人基因型寡核苷酸序列分析原位杂交人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus,HP

2、V)是小分子双链DNA病毒,具有强烈嗜上皮性,高度组织和宿主特异性,可致人类皮肤和黏膜异常增生,引起多种良、恶性病变。目前已经鉴定100多种亚型,其中近40种能感染生殖器官。根据其对生殖系统的致癌性不同,可将其分为低危型和高危型12。前者包括HPV6,11,42,43等亚型,.freelL的加盖微量离心管(1.5mL)中,采集的样本在室温放置2h,4℃保存＜24h,-20℃保存＜3个月,样本避免反复冻融。1.1.2试剂及仪器HPVDNA抽提试剂盒(QIAMini试剂盒,德国QIAGEN公司),HPV基因分型检测

3、试剂盒(中国凯普生物科技有限公司),可检测21种HPV亚型,包括13种高危亚型(16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59和68型)、5种低危亚型(6,11,42,43和44型)和3种中国人群常见亚型(53,66和CP8304型)。另外在膜上还包括用于质量控制的阴性对照点、内对照点(用于监测PCR反应)和Biotin对照点(用于监测显色系统)；HPV6/11、16、和18型实时荧光PCR检测试剂盒(深圳匹基生物有限公司)；扩增仪(PE9700，美国ABI公司)；荧光定量PCR仪(Lig

4、htCycler，瑞士Roche公司)；医用核酸分子快速杂分仪（中国凯普公司）。1.2方法1.2.1标本DNA提取取上述液体0.5mL,13000r/min离心1min,弃上清液,利用QIAMini试剂盒提取DNA,具体操作步骤按试剂盒说明书。1.2.2HybrMax法检测21种HPV亚型1.2.2.1标本DNA扩增将水、PCRMIX、Taq酶和DNA模板按要求混匀,反应体系为25μL。PCR反应条件为20℃10min,95℃预变性9min；95℃20s→55℃30s→72℃30s共40个循环,72℃延伸5mi

5、n。1.2.2.2导流杂交将扩增后的PCR产物加热变性后冰浴,同时将固定有核酸探针的膜固定在杂交仪上,进行预杂交。把PCR产物加到薄膜上,让样品流入膜内进行导流杂交,清洗除去未结合的DNA,整个杂交过程保持在45℃。1.2.2.3芯片显色及结果判读用封阻液封闭膜,孵育5min,重复2次。排出封阻液后加入酶标液,25℃温育3.5min。用冲洗缓冲液彻底冲洗膜,除去未结合的酶标液,后加入NBT/BCIP底物显色3～5min。在显色后1h内分析结果。1.2.3实时荧光PCR测定HPV亚型按照试剂说明书对每份标本检测HP

6、V6/11、16和18等4种亚型。1.3统计学处理2种方法检测结果比较用秩和检验,P＜0.05为差别有统计学意义。2结果2.1HybrMax法检测所有膜上阴性对照结果均为阴性,内对照点和Biotin对照点均为阳性。75例样本共28例阳性,其中单一感染21例,复合感染7例。HPV单一感染时,在膜芯片上相应HPV亚型探针位点处可见一蓝紫色斑点,双重或多重感染时,在膜上可见两个或两个以上显色斑点(图1)。2.2荧光定量PCR检测75例样本共检出25例阳性,其中单一HPV6/11亚型阳性15例,单一HPV16亚型阳性3例

7、,单一HPV18亚型阳性2例,HPV6/11和HPV16均阳性1例,HPV6/11和HPV18均阳性4例。2.3HybrMax法与荧光定量PCR比较75例标本HybrMax法28例阳性,荧光定量PCR25例阳性,经统计分析显示其差别无统计学意义(P＞0.05),表明二者在阳性结果中有较好的一致性,但实时荧光PCR有一定的漏检率,漏检标本包括2例53亚型及58亚型的单一感染和1例35和58亚型的复合感染。另外4例复合型感染除了有常见的6，11，16，18亚型外,还检出31，53,58,66及CP8304亚型(表1,

8、2)。在以上检测到的亚型中33，58.freelanpapillomavirusinfection/J/.ClinInfectDis,2006,43(5):624629./2/TrottierH,FrancoEL.Theepidemiologyofgenitalhumanpapillomavirusinfection/J/.Vaccine,2006,24(Suppl1)