人乳头瘤病毒基因分型液态芯片的构建

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1、人乳头瘤病毒基因分型液态芯片的构建【摘要】目的:通过构建人乳头瘤病毒基因分型的液态芯片,建立高通量、灵敏和特异的HPV型别检测系统。方法:在LuminexTM平台上,采用国际公认的标准HPV质粒建立13种基因分型HPV芯片,选择引物及探针,将探针有效的偶联到微球上。结果:用LuminexTM平台建立了13型HPV芯片,对单一或两种标准质粒混合的样品均可准确分型。对分型检测的阳性标本进行基因测序,经美国NCBI数据库BLAST比对符合其检测型别。结论:利用LuminexTM平台构建了13种HPV型别液相芯片的诊断体系,具有高通量、快速准确等特点,适用于大规模临床样本的H

2、PV基因分型的诊断。【关键词】人乳头瘤病毒（HPV）基因分型芯片　　人乳头瘤病毒（humanpapillomavirus,HPV）基因分型,对临床HPV感染疾病的诊断与治疗具有重要的意义。目前采用的PCR检测技术假阳性率较高、Southernblot或反向杂交方法进行操作繁琐,一次检测样本量有限,限制了其大规模筛查中的需要。我们拟利用LuminexTM平台系统［1-3］,构建人乳头瘤病毒基因分型的液态芯片,建立特异性强、高通量、高灵敏度的HPV型别检测系统。　　1材料和方法9　　1.1材料　　HPV31、HPV35、HPV56全基因序列质粒,由美国Researchan

3、dDevelopmentDigeneCorporationAttilaLrincz教授惠赠;HPV58全基因序列质粒由日本ToshihikoMatsukura教授惠赠;HPV45、HPV51、HPV53全基因序列质粒,由德国HeidelbergE.M.deVilliers教授惠赠;HPV6、HPV11、HPV16、HPV18含HPVL1区质粒的菌悬液,由第四军医大学皮肤科惠赠。fluorescencelabeledpolystyrenebeads（Luminexmicrosphere荧光聚苯乙烯球,直径为5600nm,带有功能性羧基,密度1.25×109/L）购

4、自Luminex公司。　　TMAC(temtrameihylammdniumchloride)Lot043k82108、MES(2［NMorpholino］ethanesulfonicacid)(C6H13NO4SFW195.2)lot042k5467;NLauroylsarcosineSodiumSaltLot082k1028均购自Sigma公司,EDC:1ethyl3(3dimethylaminopropyl)carboclirmidehyddrocloride购自Pierce(Rockford,IL);streptavidinphycoery

5、thrin(SAPE):购自MolecularProbesLot:83C21。　　1.2方法9　　1.2.1引物及探针　　根据LuminexTM平台系统的要求,选择GP5+/GP6+系统,采用deRodaHusman［4］设计。所有选择的探针参考M.V.JACOBS［5］,通过使用美国NCBI数据库做BLAST比对研究。　　1.2.2HPV感染类型　　选择占外生殖器部位HPV感染类型的96%左右的HPV低危类型HPV6、HPV11和HPV53及高危类型HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV

6、56、HPV58等为构建液态芯片的首批HPV型别。　　1.2.3探针偶联及偶联效率的检测　　通过寡核苷酸5′氨基与微球表面的羧基在偶联反应液中偶联,微球表面的羧基点通过MES和EDC而激活,为了减少蛋白在寡核苷酸与微球杂交中的相互干扰现象,探针设计时通过加上带生物素酶的碳臂,而有效的结合在微球表面。为了检测探针是否已连接到微球上,设计偶联探针的互补探针,在互补探针序列5′端加Biotin修饰。9　　1.2.4微球杂交　　将带有C14臂探针的微球与待测的PCR产物按比例在终浓度为3mol/L的TMAC反应液中混合,通过核酸解连、杂交反应和SAPE染色后,通过Lumi

7、nex100仪器（BIARAD技术平台）检测。　　1.2.5阳性质粒微球探针荧光值标准曲线的建立　　阳性质粒抽提后,以此为模板进行PCR扩增,将扩增后PCR产物进行浓度梯度稀释,各稀释产物分别与带有各型HPV探针的微球进行杂交、染色,最后进行LuminexTM100仪器BioPlex系统检测,根据BioPlex管理软件分析采用TheLogistic5PL计算标准曲线。　　1.2.6统计学处理　　使用SPSS10.0统计软件包进行统计学分析,对阳性质粒标准的检测数据,采用判别分析法,对结果进行方差分析,建立判别函数。　　2结果　　2.1阳性质粒