梓醇保护l-谷氨酸及aβ25-35损伤pc12细胞作用比较

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1、梓醇保护L-谷氨酸及Aβ25-35损伤PC12细胞作用比较【摘要】目的观察梓醇对L-Glu和Aβ25-35损伤PC12细胞的保护作用的异同。方法常规培养神经元样PC12细胞，预先加入梓醇及对照生理盐水24h后分别加L-Glu5mmol/L和Aβ25-3520μmol/L损伤24h，K252a干预组细胞在梓醇前1h加入200nmol/LK252a。MTT法测定细胞存活率，放射配基结合分析测定M2受体密度。结果梓醇100μmol/L明显提高细胞存活率(P95%。DMEM(Gibco,USA)，Aβ25-35、L-Glu、K252a、

2、四甲基偶氮唑蓝(methylthiazolyltetrazolium，MTT)(sigma,USA)，3h-QNB(Amersham公司，比活度1．54TBq/mmol)。Aβ25-35用灭菌双蒸水溶解后配成100mol/L母液无菌分装，-20℃储存，临用前37℃孵育3~5d使成为聚集状态[4]，加入DMEM稀释成所需浓度。1．2方法1．2．1细胞培养及处理PC12细胞由中国科学院上海细胞生物研究所提供，置CO2培养箱内37℃常规培养，DMEM内含10%胎牛血清、0．1U/L青霉素和0．1g/L链霉素。细胞长至铺满瓶底约90%时

3、收集细胞传代，24h换液并加入不同浓度梓醇预处理细胞，正常对照和模型组细胞加等体积生理盐水。继续培养247h，除正常对照组细胞外，其余细胞分别加入终浓度5mmol/LL-Glu持续损伤24h即细胞培养至72h进行指标检测(所有加药体积均为10l/孔)。20mol/LAβ25-35损伤细胞的实验方法同上。1．2．2细胞存活率测定(MTT法)细胞以2×107/L接种于96孔板，每孔200L。检测时每孔加5g/LMTT溶液20L，使终浓度0．5g/L，37℃孵育4h，弃上清液，每孔加DMSO150L，振荡10min，酶标仪测490nm

4、的光密度(OD)。细胞存活率(%)=用药组细胞OD/对照组细胞OD×100%。1．2．3细胞M受体密度测定细胞以2×108/L较高密度接种于6孔培养板内，每孔2mL。M受体密度采用3h-QNB单位点结合法测定。培养细胞每孔加适量预冷至4℃的0．01mol/LPBS轻轻刮取细胞，离心1800g×10min得到细胞团块，加B1缓冲液(50mmol/LTris-HCl缓冲液，pH7．4，内含10mmol/LMgCl2)混匀制成匀浆。测定时每管均加入细胞匀浆100L(约100~200g蛋白)，总结合管(TB)加B1缓冲液和3h-QNB液

5、各100L，非特异结合管(NSB)加B1缓冲液和阿托品各100L，总反应体积均为300L(以上所有操作在4℃进行)。37℃振荡孵育45min反应，反应结束后立即置冰浴终止反应，迅速抽滤至双层69型玻璃纤维滤膜，滤膜预先用0．25%PEI浸泡以降低非特异结合。滤膜80℃烘干1h后浸入1mL0．6%b-PBD二甲苯溶液，液体闪烁仪测放射性计数率(cpm)，Lowry法测定蛋白含量。PC127细胞M受体密度计算公式=总结合(cpm)－非特异结合(cpm)测量效率(%)×标记物比活度(cpm/fmol)×标本蛋白量1．2．4K252a对

6、梓醇作用的影响细胞以2×105/ml较高密度接种于6孔培养板内，每孔2mL。分为：正常对照组，模型组，梓醇终浓度100μmol/L保护组和200nmol/LK252a干预梓醇保护组。其中K252a干预组细胞在加梓醇保护前1h即细胞培养至23h预先加入终浓度200nmol/L的K252a干预，余处理同前。同上测定细胞M受体密度。1．3统计学分析所有数据以（x±s）表示，单因素方差分析，P<0．05,差异有统计学意义。2结果2．1梓醇对PC12细胞存活率的影响正常细胞加入的MTT被细胞还原产生蓝紫色结晶，分布在胞体及突起部，含量丰富

7、，L-Glu和Aβ25-3520mol/L分别作用于PC12细胞24h后细胞蓝紫色结晶明显减少，说明细胞存活率明显下降，分别下降为正常对照组的62．4%和70．1%(P<0．01)。梓醇10mol/L浓度预处理组细胞存活率较模型组增加，分别上升至正常组的69．7%和70．7%，与模型组比较差异有统计学意义(P<0．05，n=9)。梓醇100mol/L作用组细胞存活率明显升高，分别为正常组的79%和79．7%，比模型组显著提高，差异有统计学意义，(P<0．01)。72．2梓醇对PC12细胞M受体密度的影响L-Glu和Aβ25-35

8、对PC12细胞M胆碱系统都显示明显的毒性作用，5mmol/LL-Glu和20mol/LAβ25-35分别作用24h后，PC12细胞M受体密度明显下降(P<0．01)，梓醇10mol/L及100mol/L预保护细胞M受体密度较模型组升高(分别P<0．05或P<0．