灵孢多糖对mpp+ 损伤pc12细胞的保护作用

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1、灵孢多糖对MPP+损伤PC12细胞的保护作用杨海华,李毅，张丹桃，徐评议，刘焯霖,朱雯，骆飞飞【摘要】【目的】观察灵孢多糖(GLPS)对甲基-苯基-吡啶离子（MPP+）诱导损伤的PC12细胞的保护作用。【方法】将MPP+或GLPS加入体外培养的PC12细胞中，建立多巴胺能神经元损伤模型，用四甲基偶氮唑盐（MTT）检测细胞活力的变化；以乳酸脱氢酶（LDH）检测法检测培养上清液中LDH水平的改变；通过酪氨酸羟化酶（TH）免疫细胞化学法检测TH阳性细胞数及蛋白的表达。【结果】MPP+处理48h后，细胞活力降至对照

2、组的52％，经GLPS（100、200、300?滋g/mL）预处理后，细胞活力明显提高，分别为65％，75％，79％（P<0.05）。MPP+处理48h后，上清液中LDH水平较对照组明显提高，经不同浓度的GLPS预处理后，上清中LDH水平有所下降(P<0.05)，且TH阳性细胞数及表达强度明显高于MPP+组。【结论】灵孢多糖对MPP+诱导损伤的PC12细胞具有保护作用。【关键词】灵孢多糖；PC12细胞；帕金森病；1-甲基-4苯基吡啶离子帕金森病（Parkinsondisease,PD）是一种好发

3、于中老年的慢性神经系统退变性疾病，其发病机制目前尚不清楚。1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四吡啶（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP）通过在体内代谢为1-甲基-4-苯基吡啶离子（1-methyl-4-phenylpyridiniumion，MPP+）的形式而对多巴胺能神经元产生毒性作用［１］。大鼠的肾上腺嗜铬细胞瘤PC12株具有多巴胺能神经元的特点，被广泛用来建立PD细胞模型。近来，本实验室研究发现，灵芝孢子粉对PD大鼠模型中的多巴胺能神经

4、元及离体原代多巴胺能神经元均有一定的保护作用[２,３]，但其有效成份及相关机制尚不清楚。灵孢多糖是灵芝孢子粉中的主要药效成分之一，具有抗炎、抗氧化等广泛的药理活性[４]。因此探讨灵孢多糖在多巴胺能神经元保护方面的作用对PD发病机制的认识及寻找新的治疗途径有重要意义。目前灵孢多糖对MPP+所引起的PC12的损伤是否具有保护作用，尚未见有文献报道。1材料与方法1.1药物与试剂MPP+（Sigma,USA），灵孢多糖（北京协和制药），RPMI-1640培养基（GibcoBRL）,兔抗大鼠酪氨酸羟化酶多克隆抗体(T

5、yrosinehydroxylase,TH,CHEMICON)，荧光二抗FITC（DAKO公司），MTT（博理公司），乳酸脱氢酶（lactatedehydrogenase，LDH）检测试剂盒（南京建成），Hepes（Gibco），新生牛血清（杭州四季青），马血清（Gibco）。1.2细胞及培养细胞培养液为RPMI-1640，内含100mL/L新生牛血清、50mL/L马血清，青霉素100IU/mL,链霉素100?滋g/mL,Hepes0.01mol/L,在37℃5%CO2的培养箱中培养。细胞汇集至85%时进行

6、传代接种。选取对数生长期细胞进行实验。1.3分组与处理①空白对照组(control),在细胞培养体系中不加入任何药物;②单纯GLPS处理组,在细胞培养体系中加入300?滋g/mLGLPS;③MPP+处理组,在细胞培养体系中加入MPP+;④GLPS+MPP+处理组,在细胞培养体系中加入GLPS预处理30min，再加入MPP＋继续处理48h,GLPS终浓度分别为100?滋g/mL、200?滋g/mL、300?滋g/mL。1.4MTT法测定细胞活力细胞接种于96孔板,接种密度是1×105/mL,体积是200μL/

7、孔,每组细胞接种于8个孔中。细胞处理48h后,收取上清，再加入培养基180μL，每孔再加入MTT20μL,继续培养4h,然后吸出培养液,加入二甲基亚砜(DMSO)150μL,振荡10min,在酶联免疫检测仪上于570nm波长处读取标本的吸光度,各组的吸光度与对照组的吸光度比值作为细胞的活力。每个时间点各重复上述实验一次。1.5LDH水平检测用收取的96孔板中的上清进行LDH水平检测。按照试剂盒说明书进行操作。取上清液20μL，加入基质缓冲液250μL及辅酶溶液50μL，混匀，37℃水浴15min。加入2,4

8、─二硝基苯肼溶液250μL，混匀，37℃水浴15min。再加0.4mol/LNaOH2500μL,440nm处测定吸光度。1.6TH免疫细胞组化作用48h后弃去培养基以终止细胞培养，0.01mol/LPBS清洗一遍，吸尽PBS，40g/L多聚甲醛室温固定20min，PBS冲洗3次×5min。①滴加30g/L过氧化氢-甲醇50μL阻断内源性过氧化物酶，室温下湿盒孵育10min，PBS冲洗3次×5min。②滴加100