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1、200121(6)基础医学与临床BasicMedicalSciencesandClinics551文章编号:10016325(2001)06055103肌肽对PC12细胞氧化应激损伤的保护作用11*11213刘长振,王爱民,谢振华,聂丹瑶,马春,杨歌德,贺雨虹(哈尔滨医科大学1生物化学教研室;2神经生物教研室,哈尔滨150086;3清华大学生命科学院,北京100084)摘要:本研究采用过氧化氢和谷氨酸纳作用于PC12细胞,成功的制作了氧化应激损伤的细胞模型。将培养的细胞进行分组:正常对照组;
2、损伤组;分别给予过氧化氢和谷氨酸钠;肌肽保护组,同损伤组的制备,但予先加入肌肽。用MTT法检测了各组细胞的生长状态并测定了LDH活性,观察了细胞形态和蛋白电泳等。结果表明:在保护组,MTT的测定结果高于损伤组,LDH低于损伤组,其细胞生长状态和蛋白质电泳结果也与损伤组有显著差异,证明了肌肽对PC12细胞的氧化应激损伤有明显保护作用。关键词:PC12细胞;肌肽;氧化应激损伤中图分类号:Q255文献标识码:A随着自由基生命科学研究的不断进展,氧化应17西德产),高速冷冻离心机(HITACHI20PR520
3、日激损伤和抗氧化保护作用的理论已越来越受到人们本),酶标仪(BIORADModel550日本),二氧化碳的普遍关注,诸如象动脉硬化,糖尿病,Alzheimers孵箱(REVCO/LINDBERGRCO3000TVBB,美国),倒病,白内障已及衰老等均被公认是与氧化应激损伤置显微镜(OLYMPUSDP10)。[1]及自由基代谢失调相关。而寻找,研制和开发更14实验方法有效的制剂,药物用以延缓,阻止,抵制这些疾病的141细胞培养和予处理:将PC12细胞按常规培发生发展,或预防衰老,探索抗氧化剂保护细
4、胞的途养在含5%胎牛血清,10%马血清的DMEM培养基径和作用机制已成为医学领域的重要研究课题。本中,于37,含5%二氧化碳条件下培养,当细胞生文的目的是以PC12细胞作为氧化应激损伤的靶细长旺盛并贴壁后,重新悬浮细胞并将其平均分配到6胞,通过比较各组MTT的检测结果,比较LDH活力5个培养瓶中(10/mL),传代培养。标记为:正常对[2,4]水平及交联蛋白质电泳等实验,借以观察肌肽照组;损伤组,分两组:过氧化氢损伤组(加入终浓(carnosine)是否有抗氧化的神经保护作用,从而为深度100~400mol
5、/L过氧化氢),谷氨酸纳损伤组(加入研究肌肽的抗氧化机制及它的开发应用提供有意入30~50mmol/L谷氨酸钠);肌肽保护组,同损伤义的药物学依据。组的制备,但提前30min加入肌肽20mmol/L,继续培养上述细胞12~18h后,(过氧化氢组,通常培养1材料和方法12h,而谷氨酸钠组为18h)镜下观察(1010),拍照,11实验细胞最后确定,使用300mol/L过氧化氢,30mmol/L谷氨PC12细胞,购自上海细胞生物所细胞库酸纳可致细胞损伤并各组出现形态差异,继续以下12试剂实验。[3]Ca
6、nosine,NADH,MTT,购自Sigma公司;DMEM142MTT测试:按文献方法进行。通过测定线培养基,胎牛血清,Hyelone公司;胰酶,牛血清蛋白粒体脱氢酶的活性来判断细胞的损伤程度和生长状等,Sigma公司;其它试剂,均为国产分析纯。态。取生长旺盛的PC12细胞接种于96孔板,每孔513仪器100L(10/well),常规培养12h后,同上分组,分别紫外可见分光光度计(PERKENELMERLambda加入300mol/L过氧化氢,30mmol/L谷氨酸纳,和肌收稿日期:2000
7、-12-11修回日期:2001-05-30基金项目:黑龙江省自然科学基金(9717)*通讯作者:Email:Wangam@ems.hrbmu.edu.cn552基础医学与临床BasicMedicalSciencesandClinics200121(6)肽等,继续培养12~18h后,向各组加入25LMTT23SDSPAGE结果(5mg/L),再保温2h,最后加入抽提缓冲液显色,在损伤组交联蛋白含量(带1)明显高于对照组酶标仪上读取490nm吸光值。(带3)。与损伤组相比,肌肽保护组交联蛋白含量
8、143乳酸脱氢酶(LDH)活性测定:按本室建立的(带2)明显减少。提示肌肽对蛋白质氧化交联有拮方法进行,测定培养液中LDH活性,也称LDH释放抗作用(图1)。(release)实验,通过测定NADH在340nm的OD值变化来判断释放于细胞外的LDH活性,其活力与细胞损伤程度成正比。144交联蛋白质的测定:按[4]进行,分离各组分蛋白质,微量双缩脲法定蛋白含量,常规进行SDS
