神经甾体化合物对pc12细胞损伤的保护作用

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1、神经甾体化合物对PC12细胞损伤的保护作用【关键词】β淀粉样蛋白；PC12细胞；神经甾体　　阿尔茨海默病(AD)是一种可引起大脑智能进行性衰退的神经系统退行性疾病。其中,神经元外的β淀粉样蛋白(βAP)沉积，形成老年斑的中心，并造成神经元的受损，是AD重要的神经病理学特征，被公认为AD发病中的关键环节之一，因而探讨βAP的神经毒作用机制，成为AD研究中的热点〔1〕。而在神经退行性病变中，神经细胞损伤涉及多种因素，微循环障碍可导致细胞能量供应短缺，缺血后再灌注所致的一氧化氮和氧自由基损伤等，可加重细胞病变的进展。近年来研究发现神经甾体如孕烯醇酮、孕酮等，对衰老、记忆、行为等活动

2、具有调节作用，目前在中枢神经调节中所起的作用越来越被人们所重视〔2〕。CPU0303是一种新型的孕激素衍生物，本实验通过建立PC12细胞损伤模型，初步探讨其对神经细胞损伤的保护作用。　　1材料与方法　　1.1材料　　神经甾体化合物(CPU0303)为孕激素衍生物，由中国药科大学向华副教授提供，溶于DMSO配制成0.1mol/L的母液，用时加PBS稀释至所需浓度。PC12细胞株购自上海细胞所。小牛血清（杭州四季青工程材料研究所）；胰蛋白酶（华美生物工程公司）；DMEM培养基、Aβ25～35和MTT)购自Sigma公司；乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒、丙二醛(MDA)测定试剂盒均

3、为南京建成生物工程研究所产品；其余试剂均为市售分析纯。　　1.2方法　　1.2.1PC12细胞培养及其损伤模型的建立PC12细胞复苏后接种于培养瓶中，加入含10％小牛血清的DMEM培养液，置于37℃，5％CO2，饱和湿度条件下培养，2～3d换液1次。取对数生长期细胞用于实验。　　1.2.2实验分组　　空白对照组，常规加入培养液；Aβ25～35损伤模型组，加入终浓度为20μmol/L的Aβ25～35培养24h；H2O2氧化应激损伤模型组，加入终浓度为100μmol/LH2O2作用24h；给药组，用终浓度为0.01，0.1，1μmol/L的CPU0303预处理30min，然后加入各

4、损伤剂共同作用24h。每组6孔。　　1.2.3MTT法检测细胞存活率　　细胞分组处理后，每孔加入0.5mg/mlMTT20μl，置于培养箱中继续孵育4h后，吸弃孔内上清液，加入DMSO，150μl/孔，振摇10min，使结晶充分溶解。用酶标仪在波长为570nm处测定每孔的吸光值，按公式计算抑制率：抑制率%=〔（OD给药组-OD模型组）/（OD空白对照组-OD模型组）〕×100%。　　1.2.4LDH活力测定　　PC12细胞损伤作用发生24h后，收集培养液200μl，按LDH试剂盒测定说明，用全自动生化分析仪测定上清中所含LDH浓度。按公式计算抑制率：抑制率%=(LDH模型组-LD

5、H给药组)/(LDH模型组-LDH对照组)×100%。　　1.2.5脂质过氧化物MDA测定　　PC12细胞损伤后，去除原培养液，用PBS洗2次，加入0.1mol/LPBS-0.05mmol/LEDTA(pH8.0)及1%TritonX100溶解细胞，加入25%H3PO4沉淀蛋白，于4℃6000r/min离心50min，取上清液，按试剂盒说明，采用硫代巴比妥酸法测定MDA含量。按公式计算抑制率：抑制率/%=(MDA模型组-MDA给药组)/(MDA模型组-MDA对照组)×100%。　　1.3统计学处理　　两样本均数比较采用t检验，结果以x±s来表示。　　2.2CPU0303对LD

6、H释放的影响　　与空白对照组相比，模型损伤组LDH的释放明显增加（P<0.01)，CPU0303能明显降低损伤细胞LDH的释放，并有剂量相关性。见表2。表2CPU0303对PC12损伤模型中LDH含量的影响（略)　　2.3CPU0303对MDA含量的影响　　与空白对照组比较，模型损伤组MDA生成显著增多（P＜0.01），CPU0303能减少细胞MDA的生成，并呈剂量相关性（P＜0.01，P＜0.05）。见表3。表3CPU0303对PC12损伤模型中MDA含量的影响（略)　　3讨论　本研究分别采用可溶性Aβ25～35和H2O2用于PC12细胞，造成AD早期病理损害模

7、型和氧化应激损伤模型。Aβ25～35是具有生物活性的片段，在凝聚形成Aβ纤维的过程中，对神经细胞显示毒性作用，对引起与AD病相关的神经元变性起关键作用〔3〕。其机制可能是在形成Aβ纤维的过程中诱发反应性氧自由基(ROS)在神经元中聚集，氧化应激和继发钙离子平衡的破坏〔4〕。同时在病理条件下，机体产生大量自由基，或机体抗氧化防御系统遭到破坏，造成细胞结构和功能的破坏，最终导致自由基从正常线粒体电子传递链中漏出。自由基所介导的脑损伤不仅发生在缺血期间，而且在随后的血液再灌注过程中仍是