胰岛素对谷氨酸诱导PC12细胞损伤的保护作用及机制研究

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1、中山大学硕士学位论文胰岛素对谷氨酸诱导PC12细胞损伤的保护作用及机制研究姓名：姜寿峰申请学位级别：硕士专业：神经病学指导教师：边连防2003.5.21中出大学硬士论文串变羹蔓胰岛素对谷氮酸诱导PCI2细胞损伤I骢僳护律用及机制研究研究专波；神经病学硕士轿究生；姜海峰撵导数l

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3、；逸连跨主程薮耀中文攮要{豁篓(酸盼兴资避粹经毒性燕缺赢性脑瞧营蒺爨研究中黪一个鬟要盼方蘑。塔t往瓣磷突多试蔻◇懿酸耱兴套毒瞧蹲致壤鼹强亡黪方式是舔惩。嚣裁越来邃多静研究表羁谷氮酸哥以诱导缨黪凋亡，本安验利翔谷鬣黢诱导PCI2缨腺壤饶模

4、型验诞谷懿酸诱导凋亡的作鞠，并进行胺蕊素神经傈护的研究。避10筝来大壁瓣实验骚究袭鳃麟薅索其纛静经保护终矮，具有多方霆的终矮枫蠲。著试隽骧箍索鹣在藏袋盘羧襄骆瀵中麓箨爆并不援较袋子荬簿巍糖瓣{髻惩，受发现胰岛索矮脊中枢神经系统的畿接的辛率经傈护{乍粥。本实验攒鼠粥亡的角度，对麟怒素在谷氨漱诱导PCI2细胞撰饶模型上进行进一拶的搽讨。＼零鹾究蒜翼瓣；1、验透谷懿羧诱譬PCI2缀魏臻魏模溅。2、露隗骥邀囊露谷爨羧／诱导PCI2细胞损伤保护作用及与凋亡的关系。3、从胰岛素受体分予信号传导角度，孵确胰岛豢对谷氮羧诱等PCI

5、2缁臆损伤保护律稍的视青l研究。／章孝辩每方法：

6、，然齑去摔含商豁氨酸的培粪基，月PBS洗一到两次，换上辑熬禽露胰匙素分别为50mU／L、t00mU／L、200秘珏／L、400mU／L静1640培葬基，爱鬻壤鼹缝耱摹筑荟蘸羧援荡篷蘧不含骧岛素匏1640壤养基浆滚嚣继续壤葵。激下实验稳采麓上述分缀，鄹分为歪巾由大学磺士论文串变羹羹常组、谷氨酸组、50mU／L胰岛素组、100mU／L胰岛索组、200mU／L胰岛索组、400mU／L胰岛索组，并均于谷氨酸作用24h后开始进行以下实验。涉及统计的实验每组包禽20个样本。(2)MTT实验：用0．25％胰蛋白酶消化单层培养细胞

7、，用含10％胎牛血清的1640培养綦配成单个细胞悬液，然后接种在24孔培养板中。将培养板移入cO。孵育箱中，在37。C、5％C0。条件下进行培养，一般待第3天细胞生长良好，进行实验。上述培养PCI2细胞于终止培养前2～3小时，于24孔培养板中每空加入lOul的黄色四唑盐衍生物MTT溶液(5％mg／m11640)，继续培养，2～3小时后每孔加入200ul的二甲基驻砜(DMSO)溶液，终止MTT反应，精吸管反复抽吸数十次，使艚T反应的蓝色产物充分溶解。然后把培养板放在酶标仪上，同时采翊实验波长为575nm和参考波长为6

8、20nto测每孔的光密度(OD值)，每组设20榉本，取萁平均值作一实验数嚣，两对设置空白对照。(3)FDA染色与Hoechst33258荧光染色处理：将培养好的缁麓的培养基翻摔，甭PBS清洗，孺FDA和Hoechst33258染色(Hoechst33258漆色蘸先孺甲疆雷定)，筠染色5～lO分锌，褥用PBS清洗2次，在荧光显微镜下躐察记录。(4)DNA豹提取帮璩S旨糖凝胶电泳：将缨艟接季孛在25ml培养溉中，待缨您生长歪缨瞧镳满缨隗培养瓶窳板甏积熬三分之二以上瓣，即可避行实验。仍采用上述分缝法，在给谷氨酸24夺嚣慝

9、开始实验。移去1640培养基，用不食钙镁的冰冻PBS洗2次，梅收集的细腿(1500rpm5min)离心，取绷胞圈块搬入600ul缨腿裂解滚裂鳝细慰，酚、鬟仿撼提DNA，样品在lOg／L的璩脂糖凝胶上暾泳，溴化乙锭染色，紫夕}烀下鼹察撼照。(5)PKB／Akt蛋囱表达检测：裂解细胞露进行蛋白质样品的SDS-PAGE电泳，然后熄凝胶电泳的凝臼用电转移到阻相支持物硝酸纤维素膜(NC膜)上，漂洗后进行非特异性抗体越闭，而后加入Akt特异性抗体(一抗)过夜，再加入带标记的二抗，曝光、显影、定影后观察结果。结果：经培养的PCI

10、2细胞，呈圆形、梭形，多边形，为贴壁生长，可有一到多条的细胞突起出现，细胞生长迅速，培养12小时到24小时后细胞成簇生长，细胞从传代到细胞生长至铺满细胞培养瓶的三分之二以上约需要2到3天，在相差倒鬻中山大学硕士论文中文I要鼹微钱下曼强折光性，核不易见。FDA荧光染色{FDA(fluoresceindiacetate，二己酸荧光索)用于溪细胞的染色，FDA进入