oxhdl3对人脐静脉内皮细胞t―pamrna表达的影响

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1、oxHDL3对人脐静脉内皮细胞t―PAmRNA表达的影响　　摘要：目的探讨oxHDL3对人脐静脉内皮细胞株HUVEC-12细胞组织型纤溶酶原激活物（tissuetypeplasminogenactivator，t-PA）表达的影响。方法HUVEC-12细胞分别经不同浓度（0、20、40、80mg/L）HDL3、oxHDL3孵育，采用RT-PCR的方法检测t-PAmRNA表达情况。结果与0mg/LoxHDL3组比较，oxHDL3呈剂量依赖性下调t-PAmRNA的表达，以80mg/LoxHDL3浓度组减少最明显，较0mg/LoxHDL3组下降了30%（

2、P<0.05）。结论oxHDL3呈剂量依赖性下调人脐静脉内皮细胞t-PAmRNA的表达。　　关键词：t-PA；HDL3；oxHDL3；动脉粥样硬化　　中图分类号：R183.4文献标志码：A　　动脉粥样硬化病变发生的原因和发病机制一直是医学领域内的重要研究课题。已有的证据表明，动脉粥样硬化与脂蛋白代谢密切相关。Nakajima等在人腹主动脉粥样硬化斑块内膜处用oxHDL特异抗体9F5-3a检测到oxHDL的存在，并定位在主动脉内皮细胞，清道夫受体SR-B1和LOX-1是其受体[1]。最近有文献证实，oxHDL及亚型oxHDL2、oxHDL3通过激活p

3、38MAPK上调TF的表达[2]，此外，oxHDL及其亚型还可通过减少内皮细胞TFPI-1分泌[3]，减弱对TF的抑制作用，干扰体内抗凝/促凝平衡，从而促进As血栓的形成。这提示oxHDL在As发生发展中起重要作用。本文通过观察oxHDL3对人脐静脉内皮细胞株HUVEC-12细胞表达t-PAmRNA的影响，为阐明oxHDL在动脉粥样硬化发生发展过程中的作用提供新的实验依据。　　1资料与方法　　1.1一般资料HUVEC-12细胞株来源于中南大学湘雅医学院细胞中心，RPMI-1640培养基为Gibco产品；谷氨酰胺、丙酮酸钠、胰蛋白酶和EDTA为Sig

4、ma产品；胎牛血清为杭州四季清产品。通用RT-PCR试剂盒购自北京博大泰克生物公司。健康人血浆购自衡阳市血站。　　1.2方法　　1.2.1HDL3和oxHDL3的制备和鉴定HDL3的制备：采用密度梯度超速离心的方法分离健康人血浆中的HDL（1.063～1.21g/mL）、HDL2（1.063～1.125g/mL）、HDL3（1.125～1.21g/mL）；oxHDL3的制备：HDL3于4℃用PBS透析24h后。1mg/mLHDL3在37℃与含20μmol/LCuSO4的PBS溶液孵育24h。4℃，用含0.1%EDTA的PBS透析24h，换液1次/8

5、h。BCA法蛋白定量，过滤除菌，4℃避光保存。HDL3和oxHDL3的鉴定：将HDL3和oxHDL3分别进行0.8%琼脂糖凝胶电泳，oxHDL3电泳迁移率明显快于HDL3表明已经被氧化修饰。　　1.2.2细胞培养HUVEC-12贴壁生长于10%小牛血清RPMI-1640基础培养液中，培养液中含1%丙酮酸钠、1%谷氨酰胺、100IU青霉素和链霉素，在37℃、5%CO2培养箱中静置培养。每次实验前24h换新鲜培养基后加处理因素。　　1.2.3细胞总RNA提取和逆转录-聚合酶链反应收集细胞，总RNA提取试剂提取总RNA。根据之前研究[3]，t-PA引物序

6、列上游：5-GAGCCAAGGTGTTTCAACG-3，下游5-CCCATTCCCAAAGTAGCAG-3，PCR扩增产物长度399bp；内参照采用GAPGH，引物序列上游5-TCACCATCTTCCAGGAGCGAG-3，下游5-TGTCGCTGTTGAAGTCAGAG-3，PCR扩增长度为697bp。PCR反应条件：94℃下5min预变性，94℃下30s变性，58℃下30s退火，72℃下45s延伸，35个循环，72℃10min继续延伸。反应结束后，取RT-PCR产物在1.5%的琼脂糖凝胶电泳中电泳。　　1.2.4统计学处理实验所得数据均为均数±

7、标准差（x±s），组间采用方差分析及t检验，由SPSS11.0统计软件完成，P<0.05为差异具有显著性。　　2结果　　2.1HDL3氧化修饰前后鉴定琼脂糖凝胶电泳显示，见图1，HDL3成一条带。经20μmol/LCuSO4孵育20h后，由于阴离子含量增多，oxHDL3电泳迁移率明显快于天然的HDL3，表明已被氧化修饰。　　2.2oxHDL3对HUVEC-12细胞t-PAmRNA表达的影响分别用不同浓度的HDL3、oxHDL3（0mg/L，20mg/L，40mg/L，80mg/L）孵育HUVEC-1224h后，用RT-PCR方法检测各组t-PAmR

8、NA的水平，见图2。结果显示，与0mg/LoxHDL3组相比，20mg/L、40mg/L，80mg/LoxHDL3浓度组细