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1、锰对人脐静脉内皮细胞及半胱天冬酶表达影响论文【关键词】锰;人脐静脉内皮细胞;凋亡;半胱天冬酶3(caspase3);半胱天冬酶8(caspase8)摘要：目的探讨锰对人脐静脉内皮细胞系HUVEC-304细胞生长周期及半胱天冬酶3(caspas3)、半胱天冬酶8(caspase8)表达的影响。方法以100～800μmoml/L)的氯化锰分别处理HUVEC-304细胞24～72h后，四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)法检测EVC-304细胞的生长活性；流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡情况；蛋白印迹法（TTassay.Apoptosisetry(FCM).Th
2、eexpressionofcaspase3andcaspase8easuredbyTTresultsrevealedthatmanganesechloride(from100to800μmol/L)mightsuppresstheproliferationofHUVEC-304cells(inhibitoryratioe-dependentmanner.TheresultofanganesecaninhibitproliferationofHUVEC-304cellse-anddose-dependentmanner.Thesemaybeoneo
3、fimportantmechanismsthatmanganesesuppressedtheproliferationofHUVEC-304cellsandinducedapoptosis.Keyanganese;HUVEC-304cells;apoptosis;caspase3;caspase8锰可以通过诱导细胞产生不配对的电子自由基形成大量的过氧化物及影响细胞能量代谢等途径诱导细胞凋亡而发挥毒性作用〔1,2〕,但对细胞凋亡相关基因半胱天冬酶8(caspase8)、半胱天冬酶3(caspase3)及蛋白产物的影响研究较少。本研究通过体外试验.f
4、reela公司)。caspase3、caspase8一抗为鼠抗人，二抗为羊抗鼠(美国晶美生物工程有限公司)。12方法121细胞和细胞培养HUVEC-304细胞株(武汉大学细胞保藏中心)。在含有10%的胎牛血清、青霉素100u/ml及链霉素100mg/ml的RPMI-1640培养基中37℃、5%CO2条件下传代培养。取对数生长期、生长良好、细胞活性大于98%的细胞进行实验。122细胞生长活性检测采用MTT比色法，取对数生长期的HUVEC～304细胞进行实验，将不同浓度的氯化锰100～800μmol/L加入10%胎牛血清（FCS）的RPMI-1640
5、的培养基中，调细胞浓度为5×105/ml，接种于96孔，每种剂量浓度为一组，每个浓度3个平行孔，置37℃、5%CO2培养箱培养不同时间（24，48，72h）后，每孔加20μlMTT，培养4h，弃MTT，每孔加DMSO150μl，充分溶解。选择490nm波长，酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度(A)值。HUVEC-304细胞的生长抑制率=（1-实验组平均A值/对照组平均A值）×100%。123流式细胞仪检测细胞凋亡用荧光素标记的膜联蛋白V(Annexin-V-FITC)及碘化丙啶（PI）双标流式细胞仪检测细胞凋亡，分为不同浓度实验组及对照组。分别加入终
6、浓度为100～800μmol/L的氯化猛作用24h，用70%乙醇4℃固定2h，磷酸盐缓冲液(PBS)缓冲液洗3次，离心去上清。用结合缓冲液37℃孵育60min，195μl细胞悬液加5μlAnnexin-V-FITC，混匀，室温10min。用缓冲液洗涤细胞1次，在190μl结合缓冲液中重悬，然后再加10μl20μg/mlPI，流式细胞仪检测。124细胞蛋白质样品制备及蛋白定量经处理后的细胞立即弃去培养液,洗涤,离心,加预冷的细胞裂解液(01mol/LNaCl,001mol/LTrisHCl,pH76,.freelol/L乙二胺四醋酸（EDTA）,1
7、00μg/ml蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF),2μg/mL，亮肽素(Leupeptin)01ml,裂解30min,然后于10000g离心10min,取上清备用。以上所有操作均在4℃下进行。测定蛋白,并调各组蛋白浓度一致。125蛋白印迹法(nCl2培养HUVEC-304细胞24h,即可引起细胞明显凋亡,并随氯化锰剂量的增加呈剂量-反应关系。表1不同浓度氯化锰诱导HUVEC-304细胞的凋亡率（略）注：与对照比较，*P＜001；n=323锰对HUVEC-304细胞caspase3、caspase8表达的影响aleckiEA.Manganeset
8、oxicityisassociationinrasprimarystriatalneurons［J］.BrainResBull,2001
