胎盘多肽注射液对人脐静脉内皮细胞增殖的影响

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1、胎盘多肽注射液对人脐静脉内皮细胞增殖的影响【关键词】胎盘；细胞计数；免疫组织化学；胎盘多肽；内皮细胞［Abstract］Objective:Toinvestigatetheeffectsofplacentapolypeptideontheproliferationofhumanumbilicalveinendothelialcell(ECV-304)invitro.Methods：ECV-304cellsetry,andMTTin72h.Proliferatingcellnuclearantigen(PA)munohistochemistrymethodatthesametime.Res

2、ults：intherangeof25~400ml/L,placentapolypeptideshoannerandthemaximaleffectshol/L.PositivePAexpressionofECV-304correlatedotetheproliferationofECV-304invitro.［Keymunohistochemistry;placentspolypeptide;endothelialcell　　近年来，随着人们对胎盘研究的逐步深入，胎盘的加工从简单的烘干与水煮发展到生物萃取，使人们对胎盘所含的生物活性物质及其功能有了更深入的认识［1］。2007年3~10

3、月通过测定胎盘多肽注射液对人脐静脉内皮细胞(ECV-304)增殖可能产生的影响，为进一步研究利用胎盘多肽对血管内皮进行修复做初步的探讨。1材料与方法1.1材料1.1.1胎盘多肽注射液贵州益康制药有限公司惠赠。批准文号：国药准字H20046260，4ml/支。1.1.2细胞株ECV-304购自中科院上海细胞生物学研究所。1.1.3主要试剂RPMI1640培养液（美国Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；MTT和二甲亚砜（国产分析纯）。增殖细胞核抗原PA免疫组化试剂盒（北京博奥森生物技术有限公司）。1.1.4仪器二氧化碳培养箱（美国FORMA公司）、倒置相差显微镜（日本NIKON公司

4、）、酶联免疫检测仪（美国Bio-Rad公司)。1.2方法和步骤1.2.1药物及细胞处理将胎盘多肽注射液用含0.4%胎牛血清的RPMI1640培养液稀释成下列稀释度：200、100、50、25、12.5ml/L。4℃保存备用。ECV-304培养至单层，细胞处于对数生长期备用。1.2.2细胞计数取对数生长期的ECV-304细胞，0.25%胰酶消化后,用含10%胎牛血清的RPMI1640制成细胞悬液，以8×104/ml接种于96孔板，每孔100μl。待细胞贴壁后换成含不同稀释度胎盘多肽注射液的维持培养液（含0.4%胎牛血清）,并设对照，每个稀释度做3个复孔。置于37℃,5%CO2培养箱培养。加

5、药后72h各剂量组做细胞计数,重复实验3次。1.2.4增殖细胞核抗原（PA）的表达在6孔板中预置盖玻片，以8×104/ml接种ECV-304于6孔板，每孔1ml,并在每孔中补加1ml培养液。待细胞贴壁后换成含不同稀释度胎盘多肽的维持培养液。置于37℃,5%CO2培养箱培养72h，取出盖玻片，用4℃冷丙酮固定后，以免疫组织化学法检测增殖细胞核抗原PA的表达情况。ECV-304染色阳性率计算方法：分别在4个高倍视野下，计算阳性细胞数和总细胞数，阳性率=阳性细胞数/总细胞数×100%。2结果　　实验结果见表1。表中可见，与ECV-304共培养72h，除12.5ml/L组细胞数量与对照组无差异，

6、其余不同稀释度的胎盘多肽处理组较对照组差异有显著性；胎盘多肽可促进ECV-304的增殖，且呈剂量相关性，最小剂量为25ml/L，在200ml/L时发挥最大作用（P﹤0.05）。MTT比色结果显示，12.5ml/L组细胞OD值与对照组无差异，其余各组OD值与对照组存有差异，胎盘多肽可促进ECV-304的增殖，且呈剂量相关性，最小剂量为25ml/L，在200ml/L时发挥最大作用（P﹤0.05）。PA的表达各组均阳性，除12.5ml/L组外，各组阳性细胞率与细胞对照组均存有差异，且呈剂量相关性，最小剂量为25ml/L，在200ml/L时发挥最大作用（P﹤0.05）。表1不同稀释度胎盘多肽72

7、h对ECV-304细胞数量、增殖、PA表达的影响3讨论　　当前，如晚期冠状动脉病变这样的缺血性疾病严重威胁着人类健康，也成为我国病死率和病残率不断上升的主要原因［2］。血管新生是个过程，实验研究表明，血管新生和重建是一个逐步的过程，在此过程中的不同阶段，有如VEGF、bFGF和Angiopoietin-1等多种诱导因子参与。这些因子的参与对血管内皮细胞的增殖和迁移，形成均匀一致的初始血管网和后期重塑均有重要作用［3~5］。如仅用单一