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时间:2018-07-08
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1、异基因造血干细胞移植患者外周血TCRVβ亚家族克隆性增殖动态变化及其与GVHD的关系论文贾新颜,王健民,李扬秋,陈少华,章卫平,陈莉【摘要】本研究观察异基因造血干细胞移植(alloHSCT)患者外周血T细胞受体(TCR)Vβ亚家族克隆性增殖的动态变化,分析T细胞的克隆性演变与GVHD的关系。利用RTPCR方法扩增70例次alloHSCT后患者(其中17例次出现GVHD)外周血单个核细胞中24个TCRVβ基因的互补决定区3(CDR3),PCR产物经荧光标记和基因扫描分析CDR3长度,确定T细胞的克隆性。结果表明:移植患者T细胞增殖一般都经历由单克隆
2、向多克隆演变的过程,在移植后60-90天时,逐渐由单克隆转为单克隆和多克隆表达大致各占一半。120天以后,无GVHD患者大多转为多克隆性表达;而GVHD患者受免疫抑制剂和GVHD的影响,直到1年以上仍有部分呈单克隆表达趋势。GVHD患者发生GVHD或靶器官受累最明显的时候,外周血TCRVβ亚家族的表达主要呈现单/双克隆的表现.freeliliesinPeripheralBloodofPatientsTransplantedatopoieticStemCellsandItsRelationtoGVHDAbstractThisstudyicchangeof
3、clonalproliferationofTcellreceptorVsubfamiliesinperipheralbloodofpatientsreceivedallohematopoieticstemcelltransplantation(alloHSCT)andtoanalyzetherelationshipbetononuclearcellsamplesfrom70cases(17GVHDpatients)undergoingalloPBCSTpatientsentaritydeterminingregion3repertoireanal
4、ysisofTcellreceptorVβgene)usingreversetranscriptasepolymerasechainreaction(RTPCR).Theproductsationfrommonoclonetopolyclone.Atday60-90afterHSCT,halfofthecasesonoclonalandtheremaindersostofpatientsainedmonoclonalafteroneyearbecauseofimmunosuppressiveagentsandGVHDitself.Theperip
5、heralbloodofGVHDpatientsmainlyexpressedmonoclone/bicloneatthetimeoftargetorgandamageconspicuously,aftermedicationintervention,partialmonocloneorbiocloneexpressedTCRVβsubfamiliesiliescanreturntonormalpolycloningalongatopoiesisandimmunityinpatients.Keyopoieticstemcelltransplantati
6、on;GVHD;TcellreceptorVβsubfamily;Tcellclonality;genescanT淋巴细胞的活化需要两个信号:第一信号通过T细胞受体(TCR)抗原多肽MHC复合物,此过程是受MHC限制的;第二信号是由多种共刺激分子提供。TCRβ链V区基因亚家族分布和克隆性分析是了解肿瘤性或抗原特异性T细胞以及免疫功能重建情况的重要方法。TCR在重排的过程中,不同克隆所形成的抗原受体互补决定区3(plementarydeterminingregion3,.freell,吹打至无沉淀,加入EP管,置于-80℃冻存备用。RNA提取及cDN
7、A合成将已加入TRIzoL试剂冻存的细胞解冻,采用酚氯仿异戊醇提取法提取RNA[4-6],按TaKaRaRNAPCRKitAMVVer2.1试剂盒说明书进行cDNA合成反应。总反应体积为20μl,其中含5μlRNA模板,2μldNTP(包括dATP,dCTP,dGTP和dTTP),0.5μlRNA酶抑制剂(RNaseInhibitor),1μlAMV逆转录酶(AMVreverseTranscriptase),30℃10分钟,42℃30分钟,99℃5分钟,5℃5分钟,结束后以人的β2MG做为内参照检测cDNA。反转录多聚酶链反应(RTPCR)根
8、据Vβ24个亚家族基因设计相应的24个Vβ特异性上游引物,并在Cβ区设1个Cβ下游引物,引物均
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