筛选Fab抗体库的细菌展示技术的建立.pdf

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1、1090ISSN1007—8738细胞与分子免疫学杂志(ChinJCellMolllIIIILJ『1Il1)!!·论著·文章编号：1007—8738(2011)10—1090—04筛选Fab抗体库的细菌展示技术的建立徐黎明，尹成凯，任桂萍，田辉，王雪琴，丁良君，李德山(东北农业大学生命科学学院生物制药教研室，黑龙江哈尔滨150030)SION：TheFabexpressedbythebacterialdisplaysystemEstablishmentofbacteriadisplaytech-foldsefficientlyandbindstoh

2、lL一113specifically．TheplasmidnologyforFabantibodylibraryscreen-rescueworkswellanditcanavoidmutationandmis-pairinglngchains．Thisbacterialdisplaytechnologyhasthestabilityofantibodyexpression．ThisstudyhasusedthetechnologytoxuLi—ming，YINCheng-kai，RENGui-ping，TIANscreenanti-hlL-113

3、FabantibodyLibrarysuccessfully．Hui，WANGXue—qin，DINGLiang-jun，LIDe—shan[Keywords]bacterialdisplay；Fab；antibodylibrary；flowBio—pharmaceuticalLab，LifeScienceCollege，NortheastAgricul—cytometryscreeningturalUniversity，Harbin150030，China[摘要]目的：利用NlpA蛋白的前六个氨基酸(CDQSSS)将[Abstract]AIM：T

4、oestablishbacterialdisplaytechnol-抗体锚定在细菌内膜建立筛选Fabs抗体库的展示技术，为今ogyforthepurposeofFabantibodylibraryscreening，byu—后抗体的研发工作奠定基础。方法：从pNAD质粒中克隆出singsixaminoacids(CDQSSS)oftheaminotermimusofNlpAleader(含有CDQSSS序列)基因序列，利用相应的酶切NIpAproteintoanchoreantibodiestotheperiplasmicsideof位点将该序列插

5、入pComb3表达载体中构建成用于展示FabthebacteriaIinnermembrane．METHODS：TheNIpALead的重组质粒pBFD。将从pEA1质粒克隆得到的anti—humanIL一ersequences(encodingCDQSSS)wasamplifiedfrom113抗体的重链Fab和全长轻链分别插入到NIpAleader和pNADplasmid．ThePCRproductwassubclonedintopelBleader(pComb3载体自带的果胶酶基因前导肽)的下游。pComb3expressionvectort

6、ogenerateFabdisplayvector将pBFD—Fab转入到E．coliDH5ot中诱导表达，原生质球制备pBFD．TheheavychainsoftheFabgenefragmentsandthe后，采用梯度浓度的抗原进行孵育，最后经流式细胞术(FCM)检测抗体展示情况并且分选阳性群体，利片{质粒提取lightchainsoftheanti—humanIL一113(hlL一113)antibodywere的方法来替代PCR方法拯救阳性基因，转化E．coilDIf5c~，利inserteddownstreamoftheNIpAlead

7、erandpelBleaderre-用FCM再次检测该群体展示的抗体与抗原结合情7兄。结果：spectivelytoconstructthepBFD-·FabforFabantibodydis-·所展示的anti—hIL一1BFab抗体依次与抗原和FITC标记的抗原play．ThenpBFD-FabtransformedEcoilDH5awasin-特异性抗体孵育后，用FCM实时检测，结果显示出很强的荧ducedbyIPTGtoexpresstheFabantibodies．asdetected光信号并且表现出抗原浓度依赖性。拯救}iI的pBFD—

8、Fab一原byflowcytometry(FCM)，andpositivepopulationswere生质球的FCM检测