采用抗体库技术筛选抑制肺癌的功能性抗体.doc

《采用抗体库技术筛选抑制肺癌的功能性抗体.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、采用抗体库技术筛选抑制肺癌的功能性抗体作者：胡海，冉宇靓，陈立钊，遇珑，孙立新，杨治华【摘要】目的研制抑制肺癌细胞功能性单抗，为治疗肺癌提供靶向治疗剂，并为分离获得肺癌相关的分子靶标打下基础。方法从新鲜人肺癌组织分离肿瘤细胞免疫Balb/c小鼠，免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合后接种于甲基纤维素，制备大容量功能性抗体库。采用活细胞荧光、ELISA、免疫组化、肿瘤增殖、侵袭、黏附、动物体内治疗实验等方法筛选鉴定抑制肿瘤细胞的功能性单抗。结果本次融合共获得了1573株杂交瘤克隆，在能与肺癌细胞膜反应的314

2、株克隆中，154株与正常肺组织不反应或低反应。功能性筛选发现41株单抗显著地抑制肺癌细胞增殖，24株能抑制肺癌细胞对Matrigel的侵袭，15株能抑制肺癌细胞与CollagenI的黏附，进一步实验验证了2株单抗能在体内抑制肺癌移植瘤的生长。结论采用大容量功能性抗体库技术成功获得了多株具有抑制肺癌细胞恶性生物学行为的功能性单抗，其中2株可能具有靶向治疗肺癌的应用潜力。【关键词】肺癌；抗体库；功能性单抗；靶向治疗肺癌是最为常见的恶性肿瘤之一，在欧美等发达国家,其发病率在各种常见肿瘤中居首位[1]。我国亦是肺

3、癌的高发国家，每年死于肺癌的人数超过40万，且有明显的逐年递增趋势。尽管近年来肺癌的治疗手段有了较大提高，但是患者的5年生存率仍低于15%[2]。近年来美国FDA批准Herceptin和Avastin等单抗靶向药物作为一线抗癌药方案用于乳腺癌和转移性结肠癌的治疗，已在临床上取得了显著的疗效，为肿瘤治疗提供了一种全新的策略。本研究采用本室建立的高通量研制筛选功能性单抗的技术方法，获得了多株能显著抑制肺癌细胞增殖的功能性单抗，为治疗肺癌提供了有潜在应用价值的抗体靶向治疗剂。1材料和方法1.1材料小鼠骨髓瘤细胞

4、SP2/0细胞，肺癌细胞系GLC82（肺腺癌）、NCIH520（肺鳞癌）为本室保藏。6周龄Balb/c小鼠购自中国药品生物制品检定所。M199、M1640、DMEM、IMEM培养基均购自GibcoBRL公司；胎牛血清（Fetalbovineserum,FBS）系Hyclone生产；biotin马抗小鼠IgG、IgM、HRP标记羊抗小鼠IgG、IgM均购自Vector公司；αtublin兔多抗为SantaCruz生产；FITC标记的羊抗兔购自Vector公司；Cy3标记avidin购自Jackson公

5、司;PVDF膜由Millipore生产；DAPI购自Sigma公司；单抗亚类检测试剂盒均由SouthernBiotech公司生产；SP法免疫组化试剂盒购自福州迈新公司；Western6blot试剂购自普利莱公司。1.2方法1.2.1细胞培养SP2/0细胞采用含10%FBS的DMEM培养基培养；肺癌细胞系GLC82和NCIH520采用含10%FBS的1640培养基培养。1.2.2动物免疫采用临床分离的肺癌新鲜组织标本(鳞癌、腺癌各一个)分离单个细胞，以1×106～5×106细胞/（只·次）的剂量免疫5只

6、Balb/c小鼠，连续免疫12个月。1.2.3免疫荧光活细胞免疫荧光：将9000/孔肿瘤细胞接种于96孔培养板，37℃、5%CO2温箱培养2天。细胞约70%汇合后，用PBS洗涤每孔中的细胞后加入一定浓度的一抗，室温孵育1h，含1%BSA的PBS洗涤5次，每次5min；加入60μl含0.5μg/mlbiotin标记二抗或60μl含0.5μg/mlFITC标记抗体室温孵育30min，1%BSA的PBS洗涤5次，每次5min；加入60μl1∶1000稀释的Cy3Avidin，室温孵育30min后，PBS洗涤5

7、次，每次5min；最后用含10μg/mlDAPI的50%甘油50μl封闭。对于固定细胞间接免疫荧光，在加入一抗前细胞经4%多聚甲醛固定10min，0.2%TritonX100通透5min，后续试验操作同活细胞免疫荧光。上述实验中，每种单克隆抗体重复做3孔。1.2.4细胞融合待免疫小鼠血清滴度达到1∶60000以上时，取1×108免疫小鼠脾细胞与2×107处对数生长期的杂交瘤细胞系SP2/0融合。融合后接种30个于铺有甲基纤维素的直径35mm的细胞培养皿内。置湿盒中于5%CO2、37℃温箱中培养。1.2.

8、5免疫组织化学免疫组化采用SP法。杂交瘤上清采用1∶5和1∶25两个稀释度。操作程序严格按照试剂盒说明书操作，镜下阳性细胞<10%定为阴性。1.2.6ELISA采用SouthernBiotech的单抗亚类ELISA检测试剂盒测定筛选获得的单抗亚型，操作严格按照试剂盒说明书进行。1.2.7肺癌细胞增殖测定采用MTT法检测免疫小鼠血清对人肝癌内皮细胞增殖的影响。并同时采用RTCESTM(RealTimeCellElectr