T7噬菌体展示人源抗体库筛选雌二醇ScFv抗体.pdf

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1、AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterSelectionofestradiol—-SpecificSingle·-chainAntibodiesfromaT7phage·displayedlibraryofHumanScFvByCuijiaoZhaoSupervisor：Prof．ZhixianGaoDepartmentofNutritionandFoodHygieneCollegeofPublicHealthJune，201

2、4原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：日期：为J龟口厶．口?学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查

3、阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：匙日期：洲喊。≯摘要背景：雌二醇(Estradiol，E2)是一种甾体类雌激素，由于可以促进动物生长并且可以提高畜禽瘦肉比，曾经广泛应用于畜禽养殖业，残留于动物组织内的雌二醇通过食物链进入人体，通过干扰内分泌系统的功能危害人体

4、健康。因此，发展简便、快速、灵敏的检测雌二醇残留的方法非常有必要。与其他检测技术相比，免疫分析方法较适合现场检测，但是免疫分析方法的建立首先是制备高特异性抗体，制备雌二醇的高特异性抗体对于其免疫方法的建立尤为重要。目的：制备T7噬菌体尾蛋白P11并制备其多克隆抗体，筛选其单克隆抗体，并将所制备的抗体应用于噬菌体展示抗体库的筛选，从噬菌体展示天然人源抗体库中筛选单链抗体(singlechainantibody)，并实现其在大肠杆菌体内的表达，并对筛选得到的单链抗体进行性质鉴定。方法：1．以T7selec

5、t10．3b为模板扩增Pll蛋白基因片段，鉴定其序列的正确性后进行原核表达，大量纯化P11蛋白；免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。2．根据Pll蛋白的氨基酸序列设计3条抗原表面多肽，免疫Balb／c小鼠，当其效价不再升高时进行细胞融合，筛选Pll蛋白的单克隆抗体。3．采用固相筛选法和差减筛选法从T7噬菌体展示天然人源抗体库中筛选针对雌二醇的特异性抗体，而后采用噬菌体ELISA筛选针对雌二醇的特异性重组噬菌体，PCR扩增结合活性较好的重组噬菌体基因序列，构建表达载体pTIG．TRX。ScFv，实现单链抗体

6、的表达及纯化。结果：1．以T7select1O．3b为模板，成功扩增出Pll蛋白基因片段，测序结果与NCBI数据库相符，成功构建表达载体pTIG．TRX．P1l，于大肠杆菌BL21(DE3)进行表达，SDS．PAGE鉴定在约25KDa处有加强带，与预期大小相符，且表达蛋白存在于菌体破碎后上清。2．利用亲和层析柱纯化P11蛋白，SDS．PAGE鉴定Pll蛋白得到了明显浓缩，大摘要量制备的纯度较高的Pll蛋白，经BCA蛋白定量后用于免疫新西兰大白兔，六次免疫后采血制得抗Pll蛋白抗血清，辛酸．硫酸铵沉淀法

7、纯化多克隆抗体，SDS．PAGE鉴定纯化后多克隆抗体纯度较好，BCA蛋白定量抗体浓度为6．3mg／mL，抗体效价为l：32，000。3．经HPLC和ESI．MS鉴定合成的三条多肽正确，采用多肽-BSA免疫Balb／c小鼠，其效价达到l：32，000时，进行细胞融合和单克隆抗体的筛选，最后，筛选得到特异识别P11．3表位多肽的的P11蛋白单克隆抗体，并制备其腹水型单克隆抗体，采用辛酸．硫酸铵沉淀法纯化后经SDS．PAGE鉴定，结果显示纯化效果较好，BCA蛋白定量抗体浓度为3mg／mL，抗体效价为l：64

8、，000。4．采用固相筛选和差减筛选的方法对T7噬菌体人源抗体库进行了四轮筛选，采用噬菌体ELISA测定重组噬菌体对雌二醇的结合活性，结果显示：5株重组噬菌体的结合活性较好。5．扩增完成5株结合活性较好的重组噬菌体的基因序列，并成功构建表达载体pTIG．TRX．SeFv，SDS．PAGE鉴定在约25KDa处出现表达加强带，经Westernblot鉴定，ScFv得到了表达。6．将诱导表达破碎后上清经ELISA和竞争ELISA鉴定其对雌二醇的具有特异性结合活