细菌bla_（NDM-1）基因PCR检测方法的建立及应用-论文.pdf

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1、动物医学进展。2013，34(12)：145—149ProgressinVeterinaryMedicine细菌blaNDM基因PCR检测方法的建立及应用温肖会，翟少伦，丘婷。，吕殿红，贾春玲，袁洁，黄忠，周秀蓉，魏文康(1．广东省农业科学院动物卫生研究所，广东广州510640；2．华南农业大学兽医学院，广东广州510642)摘要：为了调查养殖场和农贸市场中的耐药细菌是否携带blao⋯基因，根据GenBank已公布的blaDM．基因序列设计PCR引物，优化PCR反应体系和反应条件，建立了blawDM一基因的PCR检测方法，以人工合成的bl

2、a。⋯基因作为阳性质控品，以大肠埃希茵、肺炎克雷伯茵、阴沟肠杆菌和铜绿假单胞菌等4株标准菌株为阴性对照，验证耐药细菌bla。M．基因PCR检测方法的特异性、敏感性、重复性，并对229株大肠埃希菌分离株和31株链球菌分离株进行检测。结果表明，blaDM．基因PCR检测方法的特异性、敏感性、重复性试验均成立，该方法扩增的目的基因片段为241bp，能检出的最小基因组DNA浓度为9．18×10肚g／L；229株大肠埃希茵分离株和31株链球菌分离株bla。M．基因PCR检测结果均没有出现目的条带，表明从广东省部分地区分离到的细菌分离株中没有携带bl

3、a。M．基因。该方法可作为耐药细菌blaoM-基因的早期检测、快速筛查手段在兽医临床耐药细菌检测中应用。关键词：blaNDM．基因；耐药细菌；聚合酶链反应中图分类号：$852．6；R915文献标识码：A文章编号：1007-5038(2013)12—0145—05近年来，出现了一种携带bla。M_l(NewDelhi1材料与方法metallo—B—lactamase一1)基因的细菌，医学临床上多1．1材料为使用碳青霉烯类抗生素治疗无效的大肠埃希菌和1．1．1菌株对照菌株：大肠埃希菌肺炎克雷伯菌等革兰阴性菌，它们除了对替加环素、(ATCC29

4、522)由广东省农业科学院动物卫生研究多黏菌素敏感之外，对大多数抗生素都产生了耐药所动物疫病诊断中心实验室保存；肺炎克雷伯菌性Ⅲ】]。2010年，发表在《柳叶刀》上的一篇论文称，(CMCC(B)46117)、阴沟肠杆菌(CMCC(B)携带该基因的细菌会产生一种特殊的8一内酰胺酶，45301)、铜绿假单胞菌(ATCC9027)3株标准对照菌此酶的活性部位为金属离子，因这种细菌首先在印株购自广东环凯微生物科技有限公司。待测菌株：度首都新德里出现而得名]。随后，英国、美国、比对四环素、复方磺胺甲嗯唑、阿莫西林和氨苄西林、利时、法国、日本、中国香

5、港、台湾、澳大利亚等全球多西环素和链霉素等耐药且表现为多重耐药现象的大多数国家发生了携带bla。M．基因的肺炎克雷伯229株大肠埃希菌分离株，于2010年1月至2012年菌、大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌、柠檬酸12月，分别从广州、花都、增城、东莞、四会、中山、台杆菌等细菌感染人并导致死亡病例，临床上表现超山、翁源、博罗、江门等1O个市(县)的猪、鸡、鸭等养级耐药现象【3]。bla。M．属于超广谱I3一内酰胺酶的殖场采集的包括病死动物的肝脏、心血、卵黄、肠道、一种，这种酶可分解B一内酰胺环结构，可使任何含B一粪便和健康家禽场的垫纸、

6、水源、土壤等样品中分离内酰胺环结构的抗生素失活，因此，携带这种酶的细得到，由广东省农业科学院动物卫生研究所动物疫菌可以抵抗所有含J3一内酰胺环结构的抗生素，从而病诊断中心保存。对乙酰螺旋霉素、复方新诺明、强导致临床用药困难[6]。那么，这种导致人类发病的力霉素、新霉素、林可霉素、四环素、磺胺异恶丙唑和“超级耐药细菌”在畜禽养殖场和农贸市场中是否存菌必治表现出明显耐药且均为多重耐药的31株链在?本研究通过建立该“超级耐药细菌”bla。M一基因球菌分离株，于2010年5月至2013年6月，分别从的PCR快速检测方法，以调查畜禽养殖场中分离到广

7、东不同地区的农贸市场及超市等分批采集的样的耐药细菌是否携带blaoM-基因。品，包括猪、鸡、鸭、鹌鹑、鸽子、鱼等肉的新鲜切El拭收稿日期：2013—09-02基金项目：广东省促进科技服务业发展计划项目(2O12BO403O2O1O)；广州市行业工程技术研究中心建设项目(穗科信字[2012~224—26号)；所长基金(2OlOSZJJ一005)作者简介：温肖会(1982一)，女，河南安阳人，助理研究员，主要从事动物疫病诊断和动物传染病学研究。*通讯作者146动物医学进展2013年第34卷第12期(总第246期)子和犬、猫、老鼠等的口腔拭子中

8、分离得到，由广东因质控品PCR产物40L于12g／L琼脂糖凝胶上省农业科学院动物卫生研究所细菌室提供。bla。M．电泳，切下目的条带，按凝胶回收试剂盒操作说明纯基因质控品：通过对bla。M一部