twist基因rt-pcr检测方法的建立

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1、Twist基因RT-PCR检测方法的建立作者：刘晓燕，王丽，张志霞，李娟，何涛【摘要】目的建立Twist基因的逆转录聚合酶链式反应(Reversetranscriptionpolymerasechainreaction，RT-PCR)条件，为探讨Twist功能学研究奠定方法学基础。方法根据Genebank中的Twist(NM_000474)基因序列设计引物，以GAPDH为内参照基因(NM_002046)，用RNAsimpleTotalRNAkit提取培养的肾癌细胞总RNA，按照QuantscriptRTkitQuantcDNA第一

2、链合成试剂盒说明书合成cDNA，PCR扩增操作按照TAKARA公司的LATaqwithGCBufferPCR试剂盒说明书，设置PCR反应体系并优化扩增反应条件，琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。结果采用TAKARA的LATaqwithGCbufferPCR试剂盒并通过PCR扩增条件的优化，成功建立了Twist基因的RT-PCR方法，在肾癌细胞系786-0中扩增出大小为150bp左右清晰的目的条带。结论成功摸索出了具有复杂二级结构、富含GC的Twist基因的RT-PCR扩增方法，并证明在肾癌细胞系786-0中存在Twist基因的特异性表达

3、。【关键词】肿瘤;Twist基因;RT-PCR　TheSetupofRT-PCRforTwistGeneinTumorCells8　　LiuXiaoyan,WangLi,ZhangZhixia,LiJuan,HeTao,LaboratoryofMolecularBiology,LuzhouMedicalCollege,LuzhouCity,SichuanProvince646000,P.R.China　　AbstractObjectiveTosetupthereversetranscriptionpolymerasechain(R

4、T-PCR)methodfordetectingTwistexpressionincasetomakefurtherresearchesonitsstructureandfunction.MethodsAccordingtothehumanTwistgensequenceavailableinGenbank,apairofprimerswasdesignedandthestandardizationwascalibratedbyGAPDHgeneasaninternalcontrol;totalRNAofrenalcarcinom

5、acellline786-0wasextractedbysimpletotalRNAkitandthefirstchainofcDNAwascomposedinaccordancewiththeinstructionofQuantscriptRTkitQuantcDNA;aftertheoptimizationoftheamplifyingreactionconditions,PCRwasprocessedaccordingtotheillustrationofLATaqwithGCbufferPCRkitandtheamplif

6、yingproductwasidentifiedwithagarosegelelectrophoresis.ConclusionsTwistgene,consistedof150nucleotides,wasspecificallyamplifiedinrenalcarcinomacellline.ConclusionsThemethodfordetectinghumanTwistgenewithRT-PCRwassuccessfullysetupandthetargetgenewasexpressedspecificallyin

7、renalcarcinomacellline786-0.8　　KEYWORDStumorTwistgeneRT-PCR　　Twist是胚胎发育相关基因，编码一种在胚胎发育中起关键调控作用的转录因子，在诱导细胞移动及组织塑型中起重要作用[1]。新近发现Twist具有癌基因的特征,在人类肿瘤的发生、发展、愈后、复发中具有重要作用，在人类多种恶性肿瘤中高表达，在正常组织和恶性程度低的癌细胞中无或极低表达[2]。Twist基因GC含量高(75%)，局部区域GC含量可高达90%以上，具有复杂的二级结构，故其RT-PCR方法的建立相当困难。本

8、研究以肾癌细胞系786-0为研究对象，建立Twist基因的RT-PCR方法，为探讨Twist在肿瘤尤其在肾癌中的作用机制奠定方法学基础。　　1材料与方法　　1.1材料人肾癌细胞株786-0(本实验室保存);RPMI-1640培养基、胎牛血清(Gib