twist基因rt-pcr方法建立和pab-gal4-dbd-ha-twist重组质粒制备

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1、英汉缩略词对照表英文缩写英文全称EMTEpithelial—MesenchymeTransitionBHLHBasichelix··loop··helixcDNAComplementaryDNACDSCodingsequenceDEPCDiethylPyrocarbonateEDTAEthylenediaminetetraaceticacidDMSODimathylsulroxideRT-PCRReversetranscriptionpolymerasechainGAPDHGlyceraldehyde3-phosphateDehydrogenaseTri

2、sEBPBSHydroxymethyl—aminomethaneEthidium．bromidePhosphatebufferedsaline中文名称上皮一间叶细胞转变碱性螺旋一环一螺旋互补DNA编码区序列焦碳酸二乙酯乙二胺四乙酸二甲基亚砜逆转录聚合酶链反应3一磷酸甘油醛脱氢酶三羟甲基氨基甲烷溴化乙啶磷酸盐缓冲液泸州医学院毕业硕士研究生学位论文独创·l生声明及发表承诺书本人声明所呈交的学位论文(已整理成发表形式)是我个人在泸州医学院导师指导下，由导师及泸州医学院提供一切科研条件的情况下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除了特{l,JJJrl以标注和致

3、谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。在即将毕业离校之际，本人郑重承诺：该论文将以泸州医学院的名义发表(论文作者为研究生及导师，作者所在单位为泸州医学院)，并在发表后立即将发表论文原件(期刊)寄与导师1册。X，．学位论文作者签名：衫、恕．蟊’导师签名：铴日期：o炉7年6月妒日期：硼年细易日／’I泸州医学院硕士学位论文版权使用授权书本人完全了解泸州医学院有关保留、使用学位论文的规定，即：泸州医学院有权保留并向有关部门或机构送交本人学位论文的复印件和电子版，允许

4、论文被查阅和借阅，允许有关部门或机构以电子出版物形式出版发行，并对外进行全文内容服务。本人授权泸州医学院可以将本人学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，进行数字化处理汇编、通过网络或其它途径进行交流传播，可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印、扫描或其他复制手段保存和汇编学位论文，即泸州医学院具有本人学位论文的数字化制品复制权、信息网络传播权和汇编权。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。保密口，在本人提交的学位论文属不保密∥(请在以上方框内打“√”)学位论文

5、作者签名：考私龙，·兹日期：讲6月z目。地址及邮政编码：联系电话：电子信箱：年解密后适用本授权书。导师签名：2石露骞导师签章：日期：衍6月t日联系电话：I第一部分Twist基因RT-PCR方法的建立摘要目的：Twist是胚胎发育相关基因，编码一种在胚胎发育中起关键调控作用的转录因子，在诱导细胞移动及组织塑型中起重要作用。新近发现twist具有癌基因的特征，在人类肿瘤的发生、发展、愈后、复发中具有重要作用，在人类多种恶性肿瘤中高表达，在正常组织和恶性程度低的癌细胞中无或极低表达。Twist基因GC含量高(75％)，局部区域GC含量高达90％以上，有连续的3

6、0个GC(NM000474)，具有复杂的二级结构，其逆转录聚合酶链式反应(Reversetranscriptionpolymerasechain，RT．PCR)方法的建立是一项相当困难而又费力费时的工作。本课题以肾癌细胞系786一O、肝癌细胞系HepG2、胃癌细胞系MNK和人正常乳腺细胞系Hs578Bst为研究对象，建立twist基因的RT．PCR方法，为探讨twist在肿瘤尤其在肾癌中的作用机制奠定方法学基础。方法：苏复液氮冻存的肾、肝、胃癌细胞和正常乳腺细胞株，加入RPMll640液培养(含10％的小牛血清)，置于C02培养箱中(5％C02、95％空

7、气、37"C)培养，24h更换培养液，以后每2---一3d更换一次，倒置相差显微镜下观察细胞生长情况，待细胞生长铺满培养瓶底时传代或提取RNA。用RNAsimpleTotalRNAkit提取细胞内总RNA，1％的琼脂糖凝胶电泳检测鼢队完整性，紫外分光光度计定量检测浓度、纯度。cDNA合成按照QuantscriptRTkitQuantcDNA第一链合成试剂盒说明书操作合成。PCR扩增所用引物设计根据GeneBank中的ZT歹TSr(NM基因序列，运用．O引物软．000474)Primer5件并结合01i906．0的评价分析，最后经_Blast检索以确保每条

8、引物与基因1库人类已知的其它基因无同源性，同时以GAPDH为内参照基因并设计其引