构建重组质粒基本方法

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1、构建重组质粒基本方法1.cDNA编码区片段的PCR扩增50ul×2模版15‘引物13‘引物1dNTP110×buffer5Taq1MilliqH2O402．PCR产物纯化1、加5倍体积的PB2、将Spin柱放于2ml收集管上3、加样液，14Krpm，离心1min4、弃去排出液5、加0.75mlPE,14Krpm，离心1min6、弃去排出液,14Krpm,离心1min7、将Spin柱放在洁净1.5ml的Epp管中8、往Spin柱的膜中央加入50μl的EB(或milliqH2O),静置2min,14Krpm，离心1

2、min3．双酶切载体和PCR产物分别用一下条件进行双酶切（反应体系均为30ul，37℃，酶切n小时）：载体10ulPCR产物20ul10xbuffer3ul10xbuffer3ul100xBSA0.3ul100xBSA0.3ul酶11ul酶11ul酶21ul酶21ulMilliQH2O14.7ulMilliQH2O4.7ul4．双酶切后的载体用试剂盒割胶回收1.割胶并称重，加3倍体积的QG（胶块每100mg约合100μl的体积）2.50℃，恒温10min，等到胶完全被溶解3.将一个Spin柱放在一个2ml的收集

3、管中4.加样液，14Krpm，离心1min5.弃去排出液6.加0.75mlPE,14Krpm，离心1min7.弃去排出液,14Krpm,离心1min8.将Spin柱放在洁净1.5ml的Epp管中9.往Spin柱的膜中央加入50μl的EB(或milliqH2O),静置2min,14Krpm，离心1min5．连接上述双酶切产物经过纯化（其中载体酶切产物割胶回收，PCR片段酶切后纯化步骤与上述PCR产物纯化步骤相同），在T4DNA连接酶作用下16℃连接过夜。连接体系如下：载体2ulPCR片段6ul10xT4buffe

4、r1ulT4DNAligase1ul6．转化取上述连接液5μl转化到预先制备的DH5α化学感受态细胞中，冰浴30分钟，42℃热激2min,置冰上5min，加入1mlLB培养液37℃摇床45min，离心5000rpm，1-5min（不要离心太久，以免太实），最后均匀涂布在含有100ng/ml抗生素的LB平板上（100-150ul）。将平板在37℃倒置培养过夜。挑取阳性克隆菌落转划到另一块含有100ng/ml抗生素的LB平板上，并对之进行编号，37℃倒置培养过夜。7．菌落原位PCR挑取转划后长出的阳性克隆菌落，加入

5、3ul细菌DNA提取液破细胞。将细菌裂解液作为PCR模板，其他PCR组分及PCR条件同上。PCR产物在2%凝胶上进行电泳分析。8.QIAGEN试剂盒抽提质粒1)用1.5ml管离心收集细菌，两次，共3ml左右。2)加入250ul的预冷的P1，打匀后在震荡仪上高速震荡1min。3)加入250ulP2，温和颠倒数次混匀。4)（在5min内）加入冰上预冷的溶液N3350ul，迅速温和颠倒混匀，至出现分散的絮状沉淀。5)冰上静置2min后离心，13，000rpm，10min。6)小心吸取上清于蓝色的spin柱中（勿吸到沉

6、淀）7)离心13，000rpm，1min，弃流出液8)加入750ulPE，离心13，000rpm，1min，弃流出液9)再离心一次，离心13，000rpm，1min，弃流出液。以让管内彻底干燥。10)将spin柱拿出，置于一干净的1.5ml管中，小心的在spin柱中央加入30ulMilliQH2O，或者ElutionBuffer，室温静置2min。11)离心13，000rpm，1min，收集质粒，测浓度，电泳检测。