重组质粒构建

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1、目录实验流程2实验操作31.LB液体培养基的配置32.质粒的提取43.琼脂糖凝胶电泳54.PCR65.DNA片段的回收纯化...................................................................76.目的片段与载体连接及转化...........................................................87.菌种保藏…………………………………………………………...98.双酶切反应..1010实验流程——质粒构建基因提取——1、2、3

2、PCR反应扩增目的基因——4、3DNA片段回收——5、3目的片段与载体连接及转化——6菌种保藏——7重组质粒提取——2、3重组质粒检测：（1）PCR（2）双酶切——8、5测序10实验操作1．LB液体培养基的配置【器材】锥形瓶，烧杯，量筒，分析天平，药匙，高压蒸汽灭菌锅，棉花，报纸，记号笔，麻绳，纱布等。【试剂】酵母提取物(YeastExtract)，胰蛋白胨（Tryptone)，NaCl【实验步骤】1.LB液体培养基配方（配置1L培养基）：胰蛋白胨（Tryptone)10g酵母提取物(YeastExtract)5gNaCl10g若配

3、置50ml培养基，按培养基配方比例依次准确地称取酵母提取物：0.25g、胰蛋白胨：0.5g、NaCl:0.5g放入烧杯中。蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把药匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一药品，瓶盖也不要盖错。2．溶化在上述烧杯中可先加入少于所需要的单蒸水，用药匙搅匀。待药品完全溶解后，倒入50ml量筒中，补充水分到50ml，倒入锥形瓶中。3.包扎用棉塞或纱布封住瓶口，再在棉塞外包一层报纸，用绳子以活结形式捆扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、日期。4.灭菌将上述培养基以1

4、.05kg/cm2（15磅/英寸2），121.3℃，20分钟高压蒸汽灭菌。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入4°冰箱内暂存。灭菌后，将锥形瓶放入烘箱烘干。烘干后，4°保存。【注】1.烧杯、量筒、锥形瓶应先用洗涤精洗干净，再用单蒸水润洗。2.灭菌后应立即放入烘箱烘干。3.培养基存放时间不宜过长。102．质粒的提取【器材】加样枪、灭菌的Tip头、灭菌的Ep管、离心机【试剂】灭菌水、TaKaRaMiniBESTPlasmidPurificationKitVer.2.0【实验步骤】第一次使用本试剂盒时，请将RNaseA1混浊液全部加入到So

5、lutionⅠ中，均匀混合后4℃保存。实验操作前请将SolutionⅢ置于4℃（或冰上）预冷后使用。1.大肠杆菌的培养。从平板培养基上挑选单菌落接种至1～4ml的含有抗生素的液体培养基中，37℃过夜培养。注）培养液不宜过量，培养液过量时，会因菌量太大而溶菌不充分，纯化时会影响质粒的纯度。2.取菌液，12,000rpm离心2分钟，弃上清。3.用250μl的SolutionⅠ（含RNaseA1）充分悬浮细菌沉淀。注）注意不要残留细小菌块，可以使用振荡器（Vortex）等剧烈振荡使菌体充分悬浮。4.加入250μl的SolutionⅡ轻轻地

6、上下翻转混合5～6次，使菌体充分裂解，形成透明溶液。注）此步骤不宜超过5分钟。5.加入400μl的4℃预冷的SolutionⅢ，轻轻上下翻转混合5～6次，直至形成紧实凝集块，然后室温静置5分钟。6.室温12,000rpm离心10分钟，取上清。注）此时4℃离心不利于沉淀沉降。7.将试剂盒中的SpinColumn安置于CollectionTube上。8.将上述操作6的上清液转移至SpinColumn中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。9.将500μl的RinseA加入SpinColumn中，12,000rpm离心30秒钟，弃滤液。

7、10.将700μl的RinseB加入SpinColumn中，12,000rpm离心30秒钟，弃滤液。注）请确认RinseB中已经加入了指定体积的100%乙醇。11.重复操作步骤10。12.将SpinColumn安置于CollectionTube上，12,000rpm离心1分钟。13.将SpinColumn安置于新的1.5ml的离心管上，在SpinColumn膜的中央处加入60μl的灭菌蒸馏水或ElutionBuffer，室温静置1分钟。注）把灭菌蒸馏水或ElutionBuffer加热至60℃使用时有利于提高洗脱效率。14.12,00

8、0rpm离心1分钟洗脱DNA。15.DNA经1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。【注】提好的质粒需标明时间、名称等。-20℃保存。103.琼脂糖凝胶电泳【器材】分析天平，锥形瓶，量筒，微波炉，凝胶板，梳子，加样枪，Tip头，电泳槽，电泳仪，紫