重组质粒的构建.doc

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1、重组质粒构建生物学——屠仁军(新浪)一、载体与外源片段（PCR产物）的双酶切为了保证做连接反应时有足够的外源DNA片段，应该加入1ug的DNA进行酶切反应；两种酶分别加1ul，10×buffer2ul，1ug的DNA，加水至20ul。（因此要跑胶分析DNA以及载体的浓度，取1-2ul，电泳检测其含量。1ul体积太少，可以将其稀释在9ul水中，再加loadingbuffer。6ul15000bp的marker，2500bp条带的亮度约是100ngDNA。可对比marker的亮度算出酶切回收的DNA的浓度，以便于确定连接反应时

2、的用量。ImageJ软件可以做灰度分析。）双酶切反应结束后，使用PCRcleanup试剂盒回收DNA与载体。回收完之后用同样的方法分析其浓度。（也可以用分光光度计直接测量DNA的浓度，但是，一般酶切反应之后其浓度会比较小，取1ul 稀释100倍之后浓度很低，可能已经低于仪器的测量范围，而电泳灵敏度很高，还可一排除杂带、RNA、蛋白质等对浓度的干扰。）二、连接反应载体100ng，DNA片段根据大小，1ulbuffer，1ulT4连接酶，加水至10ul；16℃连接12-16h。载体（约0.03pmol）与外源DNA的摩尔比大约

3、1：3-1：10之间，根据载体与DNA片段的长度，可算出需要的量。因为载体的大小一般在5kb-10kb，因此，严格的算出0.03pmol的载体的质量意义不大，大约100ng即可。如果时间比较紧张，可以25℃连接15min，之后可取5ul进行转化，剩余5ul于16℃继续连接。三、质粒转化到感受态大肠杆菌中从-70℃中取出感受态，指尖轻转融化后立即插入冰上，5ul连接产物+100ul感受态大肠杆菌，充分混匀后冰浴30min，然后42°热激90s，热激时不要晃动EP管。然后立即插入冰上，静置2min。（连接产物的量尽量不超过感受

4、态体积的5%，否则会降低转化效率，从而得不偿失。）在超净台中向EP管中加入700ul无抗性LB培养基，然后37℃摇床培养45min-1h；4000rpm离心3min，在超净台中弃去700ul上清，然后轻轻吹打残留的菌液沉淀，涂平板；（涂平板的玻璃棒要在酒精灯上烧热灭菌，后冷却）37℃培养箱先正放15min，之后倒置培养12-16h。（超过16h，则阳性克隆周围会生出卫星菌落，原因是阳性克隆会分泌水解氨苄的酶到培养基中，水解其周围的氨苄，因此，平板上的DH5α、杂菌等会生长。）四、重组子的挑取培养挑选单克隆到2mlLB培养基

5、中，37℃培养8-16h，可提质粒。（要在管壁上部用注射器的针头烧热，戳个小洞，因为大肠杆菌是好氧的，无菌会生长缓慢）其实在挑克隆培养的时候就可以PCR鉴定，先配好PCR反应体系，在超净台中，同一个克隆，一半用于摇菌培养，一半用小的枪头挑取在对应的PCR体系里涮一下，即可作为模版进行PCR反应。PCR时要做阴性、阳性对照。阴性对照，用枪头在没有菌落的培养基上沾一下做模版（PCR灵敏度很高，要排除连接体系中的残留的DNA对结果影响的可能），阳性对照用最初PCR扩增DNA片段时的模版。也可以等37℃培养8-16h之后取1ul菌

6、液做模版鉴定，或者提质粒之后，用质粒做模版进行鉴定，均可。五、质粒的提取与电泳检测1. 在超净台中取300ul菌液与无菌EP管中，4℃保存，待鉴定是否成功后取100ul菌液+100ul50%甘油保种，送200ul菌液到公司测序，不正确的丢掉即可。（如果质粒量很多，也可以送5-10ul质粒测序）2.取1ml菌液到新的EP管,12000rpm离心30s，弃上清，再将700ul剩余菌液于同一EP管，12000rpm离心30s，弃上清。然后瞬时离心，将残留液体吸干。（枪头不能重复使用）3.加入预冷的200ul溶液I(4℃低温保存)

7、。反复吹打混匀。（一定要混匀，不然会影响裂解效果，可以用涡旋混合器震荡混匀）4.加入200ul溶液II，盖紧管口，轻轻快速颠倒离心管3-5次。（不要剧烈震荡，防止基因组DNA、质粒断裂，可以悬空加试剂，这样不用换枪头，而且比较快，下同）5. 观察到溶液变清后，立即加入预冷的200ul 溶液III。颠倒3-5次，颠倒时用手指轻弹离心管底部，混匀。冰浴5min。12000rpm离心10min。6.取400ul上清至另一干净的离心管中（尽量不要吸到白色的沉淀物质，如果效果不理想，可以转移400ul上清至新离心管，12000rpm

8、，5min，之后在转移上清），加入500ul异丙醇，充分混匀。室温放置2min，12000rpm离心10min。7. 弃上清，加入700ul75%的乙醇，轻轻颠倒两次，12000rpm离心5min，重复操作一次。8.弃上清，然后瞬时离心，用Tip头将残留酒精吸干。空气中干燥10min。9.加入50-10