重组质粒的鉴定方法.doc

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1、重组DNA转化受体细胞后，须在不同水平上进行筛选，以区别转化子与非转化子、重组子与非重组子以及鉴定所需的特异性重组子。在转化过程中，并非每个受体细胞都被转化；即使获得转化细胞，也并非都含有目的基因，所以需采用有效方法进行筛选。筛选的方法包括根据遗传表型筛选、限制性内切酶分析筛选、核酸探针筛选、PCR筛选等。本实验采用遗传表型筛选中的抗生素平板筛选或α互补筛选的方法。一、抗生素平板筛选【实验原理】目标基因是Kan的抗性基因，而载体含Amp 的抗性基因，因此在含有Amp 和Kan的培养基中生长的菌落即为阳性菌落。【操作步骤】1．制备含有Amp 和 Kan 的LB琼

2、脂培养板 2．将100μl 转化菌液用无菌涂布器均匀涂布于含有Amp 和Kan培养板上，37℃培养12-16h 。3．在含有Amp和Kan培养板上能生长的菌落即为阳性重组质粒。并将其接种于含Kan的LB液体培养基2ml中培养8-16h。4．小量制备质粒，限制性酶切分析进一步鉴定。二、α互补筛选【实验原理】适用于含有半乳糖苷酶基因（LacZ）的载体，如 pUC系列等，其原理是：载体含有LacZ的调控序列和N端146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点。当这种载体进入可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞后（质粒和宿主细胞编码的片段各自都没有

3、酶活性），它们可以融为一体，形成具有酶学活性的蛋白质，这种现象叫α互补。由α互补而产生的 Lac+ 细菌在呈色底物 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷（X-gal）和诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）存在下形成蓝色菌落。当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，导致产生无α互补能力的氨基端片段。因此，带有重组质粒的细菌形成白色菌落。通过呈色反应即可初步识别可能带有重组质粒的菌落。通过小量制备质粒DNA进行限制酶切分析，即可确定这些质粒的结构。【试剂】1．X-gal（20mg／ml）：将20mgX-gal溶于lml二甲基甲酰胺中，-20℃避光保存。2

4、．IPTG（200mg／ml）：将1gIPTG溶于4ml去离子双蒸水中，定容至5ml，用0.22μm过滤器除菌，-20℃保存备用。【操作步骤】1．制备含相应抗生素的琼脂平板。2．于平板表面加X-gal40μl和IPTG4μl，并用无菌玻璃涂布器将试剂均匀涂布于整个平板表面。37℃静置lh。3．将100μl转化的菌液涂布于平板表面，置37℃培养箱20min后，倒置平板继续培养12～16h。4．中止培养后，将平板静置4℃4h，使蓝色充分显现，平皿上显示蓝色和白色两种菌落。5．挑取白色菌落置2mlLB（含相应抗生素）液体培养基中，37℃摇床培养8～12h。6．提取质

5、粒，以限制性酶切分析进一步鉴定。3．重组质粒的鉴定方案一菌落PCR(1)制备PCR混合液：(2)用经灭菌的10μl枪头（不用牙签）挑去白色菌落，迅速地使挑取物溶在上述混合液中。(3)盖上离心管得盖子，在沸水上温育10min。(4)将步骤⑶的样品冷却至室温，离心数秒，然后于管中加入TaKaRarTaq酶0.25ul。(5)按以下条件进行PCR反应：94℃预变性3min；然后进行30个循环反应，其温度循环条件为：94℃变性1min，57℃退火1min，72℃延伸1min；循环结束后72℃再延伸5min。(6)取5μlPCR产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。方案二

6、质粒PCR1.碱裂解法少量制备质粒DNA(1)用离心管收集4ml在LB培养基（含Amp）中培养过夜的菌液，14000rpm离心30秒，弃尽上清。(2)用250μl已加入RNaseA1的BufferS1充分悬浮细菌沉淀。(3)加入250μlBufferS2，温和但充分地上下翻转混合4-6次，此步骤不宜超过5min。*BufferS2使用后应立即盖紧瓶盖，以免空气中的CO2中和BufferS2中的NaOH，降低溶菌效率。(4)加入400μlBufferS3，温和地上下翻转8-10次，室温静置2min，14000rpm离心10min。*若离心后凝结块未沉淀到离心管底

7、部，应再上下翻转数次，12000g离心3min。(5)将DNA-prepTube置于2-mlMicrofugeTube中，将步⑷中的混合液移入DNA-prepTube中，5500rpm离心1min。(6)弃滤液，将DNA-prepTube置回到原2-mlMicrofugeTube中，加入500μlBufferW1，5500rpm离心1min。(7)弃滤液，将DNA-prepTube置回到原2-mlMicrofugeTube中，加入700μl已加无水乙醇的BufferW2，5500rpm离心1min，以同样的方法再用700μl已加无水乙醇的BufferW2洗涤一

8、次。一般有三种鉴定方法:1)阳性克隆培