重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定

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1、重组质粒的构建.转化、筛选和鉴定实验目的:1.学习在实现DNA体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶并能对限制性核酸内切酶对载体和冃的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。2.学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作。3.学习利用T4DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外DNA分子的技术，了解并学握儿种常用的连接方式。4.掌握利用Cacl2感受态细胞的方法。5.学习掌握热击法转化E.coli的原理和方法。6.掌握«互补筛选法和PCR检测法筛选

2、重组子的方法。并鉴定体外导入目的DNA片段的大小。7.学习和掌握PCR反应的基本原理和操作技术，了解引物设计的基木要求。实验原理:外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，这样重新组合的DNA分子叫做重组子。重组的DNA分子式在D7A连接酶的作用下，冇Mg2十、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶弱切的载体分子和外源DNA分子逹竝来。将垂组质粒导久感受翻他中，将转化肩的细胞在选捧性舞养基中培养，可以通过a互补筛选法備选出重组子，并可通过弱切电泳弘册磁的方法进行重组子的鉴定。1.重纽子的构建酶切时首先

3、要了解II的慕因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能目的菇因内部冇专一的识别位点，否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源工体DNA时不能得到完整的H的基因。其次要选择具有相应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子。常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的DNA片段，陋切后的片段两端将产牛相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酗处理载体。在构建重组子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA片段以相反方向插入载体分子屮，或H的DNA串联后再插入载体分子屮，甚

4、至出现载体分子自连，重新环化的现象。单酶切法简单易行单是厉期筛选工作比较复杂。各种限制性内切酶都有去最佳反应条件，最主要的因素是反应温度和缓冲液的组成，在双酶切体系中，限制性内切酶在使用时应遵循“先低盐灰高盐，先低温厉高温”的原则进行反应。（耍达到高效率的连接，必须酶切完全，酶切的DNA数量要适当。另外，酶切反应的规模也取决于需耍陋切的D7A的量，以及相应的所需陋的Son；以适当增加陋的用量，但是授高不能超过反应总体积的10%,因为限制性核酸内切酶一般是保存在50%廿油的缓冲液中，如果酶切反应体系屮甘汕的含量超过5

5、%,就会抑制酶的活性。）连接反应总是紧跟酶切反应，外源DNA片段与载体分子连接的方法即DNA分子体外重纽技术主要依赖限制性核算内切酶和DNA连接酶催化完成的。DNA连接酶催化两双链DNA片段和邻的5'-磷酸和3,-011间形成磷酸二酯键。在分子克隆中最有用的DNA连接酶是來口T4噬菌体的T4DNA连接酶，它可以连接黏性末端和平末端。连接反应时，载体DNA和外源DNA的摩尔数之比控制在1：（广3）Z间，可以有效地解决DNA多拷贝插入的现象。反应温度介于酶作用速率和末端结合速率之间，一般是16°C,用常用的连接时间为1

6、2-16ho1.感受态细胞的制备及质粒转化构建好的重组DNA转入感受态细胞中进行表达的现彖就是转化。能进行转化的受体细胞必须是感受态细胞，即受体细胞最容易接受外源D7A片段实现转化的生理状态，它决定于受体菌的遗传特性，同时与菌龄、外界环境等因素有关。人工转化是通过人为诱导的方法使细胞具有摄取DNA的能力，或人为地将DNA导入细胞内，该过程与细菌自身的遗传控制无关，常用热击法，电穿孔法等。能否实现质粒DM的转化述与受体细胞的遗传特性有关，所用的受体细胞一般是限制修饰系统的缺陷变杲株，即不含限制性内切陋和甲基化陋的突变

7、株。目前常用的感受态细胞制备方法冇CdCL法,制备好的感受态细胞可以加入终浓度为15%的无菌甘汕，-70°C可保存半年至一年。经过CaCL处理的细胞细胞膜通透性增加，允许外源DNA分子进入。在低温下，将携带有外源DNA片段的载体与感受态细胞混合，经过热击或电穿孔技术，使载体分子进入细胞。进入受体细胞的外源D7A分子通过复制、表达，使受体细胞出现新的遗传性状。将这些转化后的细胞在选择性培养基上培养，即可筛选出重组子。本实验以E.coliDH5a菌株为受体细胞，用CaCl2处理，使其处于感受态，然后将重组后的PUC19

8、质粒在429下热击90s,实现转化。2.重组子的筛选鉴定重组DNA转化猪主细胞后，并非所有的受体细胞都能被导入重组D7A分子，一般仅有少数重组DNA分子能进入受体细胞，同时也只冇极少数的受体细胞在吸纳重组DNA分子Z后能良好增殖。并且它们是与其他人量未被转化的受体菌细胞混杂在一起。再者，在这些被转化的受体细胞中，除部分含有我们所期待的重组DNA分子外，另外一