重组质粒的酶切鉴定及PCR实验.doc

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1、.重组质粒的酶切鉴定及PCR实验崔文强201300140012生态同组者：陈斌郝书平摘要PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶链式反应，是1986年由KallisMullis发现。这项技术已广泛地应用于分子生物学各个领域，它不仅可用于基因分离克隆和核酸序列分析，还可用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析等方面。本次实验旨在通过学习和掌握酶切和PCR反应的基本原理和实验技术，以验证重组质粒插入片段大小。关键词酶切；重组质粒；插入片段；PCR1.引言将含有外源DNA的转化子的E.coliDH5α菌株进行培养，并用试剂盒提取其质粒DNA，将

2、所提取的DNA用切pUC19质粒的同一种限制性内切酶进行切割以验证所插入的外源DNA的大小，这就是重组质粒酶切鉴定。接着进行PCR检验，PCR是一种利用两种与相反链杂交并附着于靶DNA两侧的寡核苷酸引物，经酶促合成特异的DNA片段的体外方法。反应过程由高温变性，低温退火和延伸等几步反应组成一个循环，然后反复进行，使目的的DNA得以迅速扩增。置待扩增DNA于高温下解链成为单链DNA模板，人工合成的两个寡核苷酸引物在低温条件下分别与目的片段两侧的两条链互补结合，DNA聚合酶在72℃将单核苷酸从引物3'端开始掺入，沿模板5'—3'方向延伸，合成DNA新链。由于每一循环所产生的DNA均能成为

3、下一次循环的模板，所以PCR产物以指数方式增加，经25—30次周期之后，理论上可增加109倍，实际上可增加107倍。PCR技术具有操作简便、省时、灵敏度高特异性强和对原始材料质量要求低等优点，但由于所用的TaqDNA聚合酶缺乏5'—Word资料.3'核酶外切酶活性，不能纠正反应中发生的错误核苷酸掺入，估计每9000个核苷酸会导致一个掺入错误，但是错误掺入的碱基有终止链延伸的作用倾向，使得错误不会扩大。1.实验材料和方法2.1实验材料PRC扩增仪，琼脂糖凝胶电泳设备，移液器，0.2ml薄壁PCR管，凝胶成像仪，模板pUC19重组质粒，寡核苷酸引物（上游引物M13F，下游引物M13R），

4、TaqDNA聚合酶（TaKaRa，-20℃贮存），dNTPs（TaKaRa，-20℃贮存），10×PCR反应缓冲液（TaKaRa，-20℃贮存）高速离心机，电泳仪，制胶槽，电泳槽，梳子，锥形瓶，量筒，移液枪，冰盒，枪尖，Eppendorf管，微量移液器，手套，记号笔，TAE电泳缓冲液(10×)，琼脂糖，溴化乙锭(EB)，DNA相对分子质量标准物DNAMarkerk／HindⅢ，DL5000。2.2实验方法2.2.1重组质粒的酶切、电泳检测对于电泳显示插入片段在2.0kb以上的重组质粒，采用HindⅢ酶切进行验证。大片段或高产量的重组质粒推荐的反应体系（10μl体系）如下：表1质粒酶切

5、反应体系成分体积（μl）*4ddH2O6.22610×Buffer（含Mg2+）1.04Re-Puc192.0HindⅢ（15U/μl）0.83.2共计10.08μL/tube轻弹混匀后，短暂离心，于37℃孵育1.5hr后，保存于-20℃，备电泳检测。Word资料.取酶切产物10ul，加入2ul10×loadingbuffer，混匀后点样。取重组质粒2ul，加入4μLddH2O，1ul10×loadingbuffer，混匀后点样。以λDNA/HindIII为Marker，点样顺序如表2。100V恒压电泳约40min。电泳结束EB染色10min，水洗后紫外灯下观察实验结果。表2重组质粒

6、酶切上样顺序泳道1234…15161718样品Λ/HindⅢpUC19/HindⅢRp1-1rp1-1HindⅢRp7-1Rp7-1HindⅢpUC19/HindΛ/HindⅢ样量μL10510101010510作用M对照对照对照M对照2.2.2重组质粒的PCR验证对于电泳显示插入片段在2.0kb以下的重组质粒，采用PCR进行验证。引物此次重组用到的载体是pUC19，限制性内切酶为HindⅢ，所以选择HindⅢ酶切位点两侧一定距离的序列制作引物。由于载体pUC19上两引物间序列的长度是150bp，所以PCR扩增产物的长度（bp）=150+插入片段的长度。实验中首先建立反应体系：表3P

7、CR引物引物名称引物序列5’3’引物长度(mers)Tm(℃)M13F(-47)CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC2464.7M13R(-48)GAGCGGATAACAATTTCACACAGG2457.9表4PCR反应体系编号组分加量（ul）1ddH2O13.2210×Buffer（含Mg2+）2.03dNTP（2.5mMeach）1.64M13F（10μM）15M13R（10μM）16模板（1-10ng/μl）1.07Taq酶（5u/μl）