重组质粒酶切鉴定及PCR实验

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1、重组质粒酶切鉴定及PCR实验重组质粒的酶切鉴定及PCR实验%1.实验目的1.检验垂组质粒的插入片段的人小2.学习PCR技术的使用%1.实验原理(-)重组质粒酶切鉴左将含有外源DNA的转化子的E.coliDH5a菌株进行培养，并用试剂盒提取其质粒DNA,将所提取的DNA川切pUC19质粒的同一种限制性内切酶进行切割以验证所插入的外源DNA的大小。(二)PCRPCR(PolymeraseChainReaction)即聚介酶链式反应是1986年由KallisMullis发现。这项技术已广泛地应用于分子生物学各个领域，它不仅可用

2、于基因分离克隆和核酸序列分析，还可用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析等方而。木次实验旨在通过学习和掌握PCR反应的基木原理和实验技术，以验证重纽质粒插入片段大小。1.聚合酶链式反应原理PCR是一种利用两种与相反链杂交并附着于靶DNA两侧的寡核苜酸引物，经酶促合成特异的DNA片段的体外方法。反应过程由高温变性，低温退火和适温延伸等儿步反应组成一个循环，然后反复进行，使tl的的DNA得以迅速扩增。置待扩增DNA于高温下解链成为单链DYA模板，人工合成的两个寡核昔酸引物在低温条件下分别与冃的片段两侧

3、的两条链互补结合，DNA聚合酶在72°C将单核昔酸从引物3'端开始掺入，沿模板5'—3'方向延伸，合成DNA新链。出于每一循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，所以PCR产物以指数方式增加，经25—30次周期Z后，理论上可增加109倍，实际上可增加107倍。PCR技术具冇操作简便、省时、灵敏度高特异性强和対原始材料质量耍求低等优点，但由于所用的TaqDNA聚合酶缺乏5'—3'核酶外切酶活性，不能纠正反应中发生的错误核芹酸掺入，估计每9000个核昔酸会导致一个掺入错误，但是错误掺入的碱基有终止链延伸的作用倾向，使得错

4、误不会扩大。2.PCR的反应动力学PCR技术类似于DNA的天然复制过程，其特杲性依赖于与靶序列两端互补的寡核昔酸引物。PCR由变性一退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DYA经加热至93°C左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使Z成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55°C左右，弓I物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板一引物结合物在TaqDNA聚合酗的作用下，以

5、dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循坏变性一退火一延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而11这种新链又可成为下次循坏的模板。每完成一个循环需2〜4分钟，2〜3小时就能将待扩忖的基因扩增放大几百万倍。到达平台期（Plateau）所需循环次数取决于样晶中模板的拷贝。PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA扩増量可用Y=（l+X）n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数,X表示平（Y）均每次的扩增效率，n代表循坏次

6、数。平均扩增效率的理论值为100%,但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竞争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。1.PCR扩增产物可分为氏产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限泄在两个引物链5'端Z间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板

7、不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的D¥A为模板，引物是从3,端开始延伸，其5,端是固定的，3'端则没有固定的止点，长短不一，这就是长产物片段。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，述要同新合成的链（即长产物片段）结合。引物在与新链结合时，曲于新链模板的5,端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3,端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的短产物片段。短产物片段是按指数倍数增加，而长产物片段则以算术倍数增加，儿乎可以忽略不让。这使得PCR的反应产物不

8、需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。%1.实验材料及仪器1.实验材料：PRC扩增仪，琼脂糖凝胶电泳设备，移液器，0.2ml薄壁PCR管，凝胶成像仪,模板PUC19重组质粒（插入片段125bp和564bp）,寡核昔酸引物（上游引物M13F,下游引物M13R）,TaqDNA聚合酶（TaKaRa,-20°C