质粒制备绝对定量PCR标准曲线方法的建立

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1、万方数据农业生物技术学报，2011年，第19卷，第6期，第1157～1162页JournalofAgriculturalBiotechnology，2011，V01．19，No．6，1157-1162技术改进UpdatedTechnology质粒制备绝对定量PCR标准曲线方法的建立李丽赵成萍李宏李武峰张利环许冬梅王金胜李惹锋+山西农业大学生命科学学院，太谷030801+通讯作者，lihuifengtom@yahoo．com．cn摘要用质粒制备绝对定量PCR标准曲线存在着作为标准品的双链环状质粒分子与待测样品单链线性

2、eDNA分子结构不一致的问题。为了消除二者之间的差异，确保绝对定量PCR测定方法的准确性，我们在用质粒制备标准曲线和测定未知样品中特定基因mRNA分子拷贝数时进行了两个改进：1)用酶切的方法使环状质粒线性化，用线性质粒制备标准曲线；2)将未知样品eDNA扩增出一条正义链，再与作为标准曲线的质粒标准品同时开始荧光定量PCR循环。实验结果表明，1)具有相同拷贝数的环状和线性质粒在一起进行定量PCR测定时，环状质粒所得的Q值大于线性质粒所得的Q值(P<0．05)；2)本研究测定的eDNA样品中先扩增一次测出的起始拷贝数均

3、大于未先扩增一次的测定结果。样品起始拷贝数两次测定结果的差异分析表明5个样品中有3个样品的测定差异达到了显著水平(P<0．05)。应用该方法改进的鸡GATA5基因绝对定量PCR的标准曲线能够准确地反应目的产物扩增。经改进的质粒制备绝对定量PCR标准曲线的方法更为简便易行，并提高了测定的准确性。关键词质粒，标准曲线，绝对定量PCREstablishmentofthePlasmidStandardCurveGenerationMethodforAbsoluteQuantificationPCRLiZhaoChengpi

4、ngLiHongLiWufengZhangLihuanXuDongmeiWangJinshengLiHuifeng+ShanxiAgriculturalUniversity，CollegeofLifeSciences，Taigu030801，China+Correspondingauthor，lihuifengtorN@yahoo．corn．cnDOI：10．3969，j．issn，1674-7968．2011．06．024’AbstractUsingplasmidvectortobuildstandardcurv

5、eforabsolutequantificationPCR(AQ—PCR)mightinduceerrorbecauseofthemoleculardifferencebetweensuper--helixdouble·-strandplasmidDNAandlinearsingle-·strandeDNAsample．ToincreasetheexactitudeoftheAQ—PCR，weimprovedthe,methodbyaddingtwostepsduringthequantityassayproces

6、sionoftargetgenemRNAcopyinunknownsamples．1)Theplasmidwasdigestedtobelinearbyrestrictionenzymesforbuildingstandardcurve；2)TheunknowneDNAsampleswereamplifiedtomakeasensestrand，followedthefluorescencequantitativePCRcyclewithstandardplasmidtogether．Theresultsindic

7、atedthat1)ThesamecopyofcircularandlinearplasmidstartedAQ—PCRtestatthesametime，theCtvalueofcircularplasmidwaslargerthanthatoflinearplasmid(P=0．05)；2)ThemeasuredstartingcopynumbersofeDNAsamplesamplifiedoncewerelargerthanthatofeDNAsamplesunamplified．Themeasuredre

8、sultsofstartingcopynumberbetweenamplifiedandunamplifiedshowedthattherehave3of5samplesweresignificantdifferences(P<0．05)．Usingtheseimprovements，thestandardcurveofchickenGATA5genewas