cfl2基因半定量多重rt-pcr检测方法的建立

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1、CFL2基因半定量多重RT-PCR检测方法的建立【摘要】目的在CFL2基因功能的研究中，建立一种能检测CFL2基因mRNA表达水平的半定量多重RT-PCR体系。方法细胞总RNA经反转录合成cDNA，以GAPDH为内参与CFL2进行同管扩增，以常规PCR体系为参照对退火温度、Mg2+、dNTP和循环数等参数进行优化并与常规组比较,建立了检测C2C12细胞CFL2基因半定量多重RT—PCR体系。结果CFL2和GAPDH的cDNA同时PCR扩增后电泳条带清晰，与预期产物大小一致，两对引物间无明显竞争，其扩增效率和特异性与单一基因的RT—PCR体系

2、相同。结论成功建立CFL2基因半定量多重RT—PCR方法，有利于半定量检测CFL2mRNA表达变化。【关键词】CFL2基因;半定量RT-PCR;检测方法Abstract:ObjectiveToestablishasemi-quantitativemultipleRT-PCRmethodforthemeasurementofmRNAlevelinCFL2gene.MethodscDNAwassynthesizedwithtotalcellRNAbyreversetranscriptionandamplifiedtogetherwithPCRp

3、rimersofCFL2andGAPDH(asinternalcontrol)genes.Inthissystem,theannealingtemperature,Mg2+anddNTPconcentrations,andcyclenumberwereoptimizedwithreferencetotheconventionalPCRsystem.ResultsTheresultshowedthattheelectrophoresisbands10ofCFL2andGAPDHcDNAamplifiedtogetherbyPCRwereall

4、clearandtheirsizeswereexpected.InourRT-PCRsystem,therewasnoobviouscompetitionofamplificationbetweenprimersetsandtheefficiencyandspecificityofamplificationwereidenticalwiththoseinsimplegeneRT-PCRsystem.ConclusionsAsemi-quantitativemultipleRT-PCRmethodwasestablishedsuccessfu

5、llywhichwouldbebeneficialtomeasuretheexpressionlevelofCFL2mRNA.　　Keywords:CFL2gene;semi-quantitativeRT-PCR;detectionmethod　人类基因组计划的完成,标志着人类进入了后基因时代。在研究不同实验条件下特异基因表达水平的差异时,半定量RT-PCR检测方法因其成本低、操作简便、普通实验室容易做到,对设备和研究者要求低等特点而被经常使用,尽管目前已有许多改进的检测方法和技术用于定量分析mRNA表达量,但实际上多数研究的焦点并不是检测

6、转录水平微小的变化或确切的分子数目,而是检测其表达水平变化是否显著(至少增加或减少1.2倍以上)[1]。只要对相关参数通过正确的实验并进行合适的控制,半定量RT-PCR完全可以反映基因的表达水平[1-5]19-25。Cofilin2(CFL2ormuscle-type10cofilin)基因是一个与肌肉肉质密切相关的基因，CFL2基因高表达对细胞内某些肌球蛋白重链基因的表达有明显影响，推测CFL2基因可能与猪的不良肉质性状相关从而导致猪肉的品质下降,肉多汁性减少,口感变差[6]。本文将以GAPDH基因作为内参基因，同管扩增CFL2和GAPD

7、H，通过实验建立一种检测CFL2基因表达水平的半定量方法，为研究CFL2基因表达提供参考。　　1实验材料与方法　　1.1细胞及主要试剂C2C12细胞株购于北京中国协和医科大学细胞中心;胎牛血清(FBS)和Trizol分别购自Hyclone和Invitrigen公司;TaKaRaRNAPCRKit(AMV)Ver.3.0反转录试剂盒;引物由大连宝生物公司合成。　　1.2C2C12细胞总RNA的提取利用Trizol法对总RNA进行抽提,DEPC水溶解,用核酸分析仪测定260、280和310nm波长处OD值,观察RNA完整性和有无降解及基因组DN

8、A污染。　　1.3反转录按照TaKaRa公司AMV反转录试剂盒说明书进行,选择RNA纯度高完整性好的RNA样品转录15管,以保证对RT-PCR体系优化过程中拥有含量一致模板。