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1、用半定量RT-PCR法分析基因表达水平的影响因素贵州农业科学2009,37(8):28~30GuizhouAgriculturalSciences[文章编号31001—3601(2009)08—0510—0028—03用半定量RT—PCR法分析基因表达水平的影响因素陈名红,陈毅坚,叶艳青,苏源,李成云(1.云南民族大学化学与生物技术学院,昆明650031;2.云南农业大学农业生物多样性与病虫害控制教育部重点实验室,昆明650201)[摘要]半定量逆转录聚合酶链式反应(Sem._QRT_PCR)以其灵敏,简捷及特异性高等优点已逐渐成为分析基因表达水平的一种有效手段.着重对用半定量RT
2、-PCR法分析基因表达水平的相关影响因素进行了综合论述,并讨论了半定量RT-PCR法在基因表达研究方面的应用潜力.[关键词]半定量逆转录聚合酶链式反应;基因表达;影响因素[中图分类号]S188[文献标识码]ATheFactorsAffectingAnalysisofGeneExpressionLeveIbySemi.QRT.PCRTechniqueCHENMing—hong",CHENYi-jian,YEYan-qing,SUYuan.,LICheng—yun.'(1.TheSchoolofChemistryandBio-techniqueofYunnanNationalities
3、University.Kunming,Yunnan650031:2.KeyLaboratoryofTheMinistryofEducationalforAgro-biodiversityandPestsControl,YunnanAgriculturalUniversity,Kunming,Yunnan650201,China)Abstract:Semi—QRT-PCRisarapid,simpleandhighlyspecificmeansinanalysisofgeneexpressionlevelinrecentyears.Thispaperdescribesfactorsa
4、ffectinganalysisofgeneexpressionlevelbytheSemi-QRT-PCRtechniquecomprehensively.andalsodiscussesthepotentialapplicationoftheSemi-QRT-PCRtechniqueingeneexpressionresearch.Keywords:Semi—QRT-PCR;geneexpression;influencingfactor高等生物基因表达的变化是调控细胞生命活动过程的主要机制,通过比较不同类型细胞或同一类型细胞在不同生理状态下或在不同生长发育阶段的基因表达差异,
5、可为分析生命活动过程提供重要信息.半定量逆转录聚合酶链式反应(semi—quantita—tivereversetranscriptionandpolymerasechainre—action,Semi—QRT—PCR)是近年来常用的一种灵敏,简捷及特异性高的基因表达水平的检测方法[1],其原理就是将总RNA逆转录成cDNA,然后扩增目标cDNA和内参cDNA,根据PCR产物量将目的基因的量除以内参的量的比值计算样品中mRNA的相对数量[{].与经典的检测基因的表达方法如Northern印迹,RNase保护分析,原位杂交及S1核酸酶分析等相比,半定量RT—PCR法具有灵敏度高(比杂
6、交法高1000～10000倍),专一性好,快速简便,所需样品量少及耗费较低等诸多优点.然而,已有的研究表明,由于用半定量RT-PCR法分析基因表达水平的影响因素较多[6.,导致该法目前只能用于粗略比较样品问的基因表达水平.因此,如何控制影响半定量RT-PCR准确性的因素以提高半定量RT-PCR法的可靠性是相关研究者需共同面临的课题.为全面掌握半定量RT—PCR方法,提高基因表达水平的分析能力,有必要对用半定量RT—PCR方法分析基因表达水平中的相关影响因素加以综合分析.1提取组织总RNA1.1组织材料的预处理在所有RNA实验中,最关键的因素是分离得到全长的RNA,而实验失败的主要原
7、因是RNA酶的污染.在实验中,一方面要严格控制外源性RNA酶的污染;另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶L8].由于样品离开活体或原来的生长环境后,样品中的内源性的RNA酶即开始降解RNA,降解速度与RNA酶含量及温度有关.因此,样品取材后应立即置于液氮中速冻,然后可以移至一7O℃冰箱保存.RNA酶极为稳定且广泛存在,其可耐受多种处理而不被灭活,如煮沸,高压灭菌等,但几乎所有的组织中均存在RNA酶,人的皮肤,手指,唾液,试剂,容器等均可能造成污染,为此,必须从获取
