半定量rt-pcr和snps技术的分析两个鸡品种tcf3基因表达水平及多态性

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1、1102979分类弓UDC学校代码密级学位论文半定量RT—PCR和SNPs技术分析两个鸡品种TCF3基因的表达水平及多态性卞良勇指导老师：至垒至墼篮扬刿盘堂至三菱扬型!!i!!!申请学位级别：学科专业名称：塑塑堂焦直登鱼鳘堕论文提交日期：!QQ!生!且论文答辩Lt期：!Q!!主i月学位授予单位：堑刿盘堂学位授予日期：答辩委员会主席：鲞甚墨丝蕉论文评阅人：塞』丝盐塾篮一塞9丛丝堑塞员2007年5月半定量RT—PCR和SNPs技术分析两个鸡品种TCF3基因的表达水平及多态性研究生：卞良勇导师：王金玉教授专业：动物遗传育种与繁殖(扬州大学动物科学与技术学院江苏扬州225009)摘要TC

2、F3基因，(又称E2A，免疫球蛋白增强子结合因子E12／E47，ITFl)是一些细胞系的转录调节因子，编码一些组织生长和发育的碱性螺旋．环．螺旋(bHLH)家族的成员，如E12和E47。本次试验以京海黄鸡和苏禽黄鸡两个培育为研究对象，研究不同组织TCF3相对表达水平，筛选基因序列中的单核苷酸多态性(SNPs)以及它们与表型性状的相关性。每个品种于16周龄时随机选择30个混合性别的个体用于实验测定。全血提取基因组DNA，肾、肺和脾组织提取RNA。用分光光度计和电泳仪分别测定DNA和RNA的纯度和完整性。反转录聚合酶链式反应(RT_PCR)的结果表明，在连续稀释的cDNA中移接变异的

3、E12和E47的表达模式非常相似。两对引物用于RT-PCR反应体系中分别扩增目标基因TCF3和看家基因。用ImageQuant软件计算出TCF3基因(T)与p-actin(C)扩增产物(pg)的相对表达水平之比(T／C)。结果表明，在肾，肺和脾组织中京海黄鸡(6．07：t=1．84，5．39士3．27和7．51士6．06)的相对表达水平高于苏禽黄鸡(5．12a：3．57，3．91士2．48和4．52士3．12)，其肾、肺和脾组织中相对表达水平分别增加了18．55％，37．85％和66．15％。结果还表明，在这两个鸡品种中，肺和脾组织的表达水平差异显著(p

4、公鸡的TCF3表达水平相应高于母鸡。而且在所有表达的组织中都有该趋势，且在肾和肺组织中公母鸡的差异显著(p<0．05)。由此推测TCF3相对表达水平有显著的性别效应。用单链构象多态性来分析(SSCP)两个鸡品种的TCF3基因的不同序列单核苷酸多态性(SNPs)。结果在京海黄鸡中没有发现SNPs。然而，在苏禽黄鸡中存在单核苷酸多念性，并用SSCP．PCR产物直接测序来验证。引物Exl401一Exl402的SSCP．PCR产物测序发现在139nt处有单核苷酸位点C—T突变。哈代温伯格平衡(HwE)分析苏禽黄鸡TCF3基因引物Exl401--Exl402的基因型频率和基因频率。引物Ex

5、l401--Exl402的等位基因A和B的频率在苏禽黄鸡中的频率分别为0．80和0．20，卡方检验表明引物Exl401--Exl402的基因型在苏禽黄鸡群体中差异不显著(p>0．05)。根据引物Exl401--Exl402单核苷酸位点分布，该群体处于哈代温伯格平衡状态。不同组织中TCF3相对表达水平和引物Exl401--Exl402单核苷酸位点多态性的基因型相关分析表明：苏禽黄鸡不同组织中AA基因型的表达水平高于AB的表达水平。肾、肺和脾中AA基因型的表达水平分别为5．762--1=4．004，4．290-a：2．212和5．059士3．249，而AB基因型的表达水平相应的分别为

6、4．272士2．883，3A35士2．867和3．106士2．506。基因型AA和AB在脾组织中的相对表达水平呈极显著相关(P<0．oi)。活体重和TCF3在鸡的肾、肺和脾组织中相对表达水平用最小显著差数法(LSD)分析其差异显著性，结果表明差异不显著；但是AA基因型个体的相对表达水平高于AB基因型个体。不考虑基因型差异，在两性中肾和肺的相对表达水平差异显著(p

7、因表达微妙差异的一种灵敏方法，这些差异比RNA装载更能反应表达水平的真实变化。此外，个体特定基因的相对表达的变化与其它表型性状，单核苷酸多态性(SNPs)和分离DNA序列变异的常见类型之间的相关性是判定等位基因和基因相对表达水平之间相关性的一种可靠的基因分型方法。关键词：基因表达，半定量RT-PCR，SNPs，TCF3Semi-quantitativeRT-PCRandSNPsTechniquestoAssessExpressionLevelandMutationofTCF3Ge